MPP⁺/6-OHDA神经毒性模型中如何评估ROS？——以 SH-SY5Y / PC12 为例
在帕金森病（Parkinson’s disease, PD）等神经退行性疾病研究中，氧化应激（oxidative stress）和 ROS 过量 是被反复提到的关键环节之一。
体外实验中，最常用的做法是：
用MPP⁺或6-OHDA在
SH-SY5Y、PC12 等细胞中建立神经毒性模型，
再检测细胞内 ROS、线粒体功能、凋亡等指标，
来评价“毒性有多重”和“保护作用有多强”。
这篇文章以CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法，KTB1910）为例， 整理一套在MPP⁺ / 6-OHDA 模型中做 ROS 实验的设计思路和操作框架，方便直接落地或按需调整。
一、两类经典 PD 相关神经毒性模型
1. MPP⁺ 诱导的神经毒性模型
常用细胞包括：
- SH-SY5Y：人来源神经母细胞瘤细胞，易培养，可作为多巴胺能神经元的替代模型；
- PC12：大鼠嗜铬细胞瘤细胞，分化后可表现出神经元样特征。
常见实验思路是：
以MPP⁺ 处理 SH-SY5Y 细胞，
检测ROS 水平（SH-SY5Y MPP⁺ ROS）、细胞活性和凋亡；
或在PC12 细胞中建立 MPP⁺ 诱导的氧化应激模型（PC12 MPP⁺ 氧化应激），
评价候选化合物是否具有神经保护作用。
在文献中，SH-SY5Y 常用的 MPP⁺ 处理条件多数在0.5–1.5 mM，24 h 左右， PC12 中则多见200–500 μM，24 h 左右 的设置。具体浓度和时间仍需结合预实验调整。
2. 6-OHDA 诱导的神经毒性模型
6-OHDA（6-hydroxydopamine） 也是 PD 相关研究中非常常见的一种神经毒素。
常用在SH-SY5Y 等细胞中，
通过几十到一百 μM 级别的 6-OHDA 处理数小时到 24 h，
诱导 ROS 升高、线粒体功能受损和细胞死亡。
相比 MPP⁺，6-OHDA 更偏向“强氧化应激 + 线粒体毒性”，
适合与 GSH、MDA 等指标配合，构建一条完整的“氧化应激 → 线粒体损伤 → 细胞死亡”路径。
二、模型条件：浓度与时间先划出一个“工作区间”
下面给的是适合作为预实验起点的区间，不是唯一标准答案。
1. MPP⁺ 模型建议区间
- SH-SY5Y：
- 浓度：0.5–1.5 mM
- 时间：以24 h 为经典终点，可视课题增加 6 h 等早期时间点；
- PC12：
- 浓度：0.2–0.5 mM（200–500 μM）
- 时间：同样可从 24 h 起步，再增加 6 h 等早期观察点。
实操建议：
第一次在某细胞上搭 MPP⁺ 模型时，不要直接“一口气认定一个浓度”；
可以取 2–3 个浓度（比如 SH-SY5Y：0.5 / 1 / 1.5 mM；PC12：0.2 / 0.5 mM），
在 24 h 终点做一轮 CCK-8 + 形态观察，再根据损伤程度决定后续主力条件。
2. 6-OHDA 模型建议区间
- SH-SY5Y：
- 浓度：50–100 μM
- 时间：6 h可作为早期观察点，24 h 作为终点观察点。
6-OHDA 溶液一般需要现配现用，
常用做法是用含抗坏血酸的缓冲液（如含适量抗坏血酸的 PBS 或培养基）配制母液，以提高稳定性。
实操建议：
组合 2–3 个浓度（如 50 / 75 / 100 μM）和 2 个时间点（6 h / 24 h），
一次性摸清在“你的培养条件 + 你的细胞”下，
哪个组合既能诱导清晰的毒性，又不会直接把细胞全部“打没”。
三、在神经毒性模型中用 KTB1910ROS活性氧试剂盒 检测 ROS：通用操作框架
以下以SH-SY5Y + MPP⁺ 为模板，6-OHDA 或 PC12 只需在刺激条件上做对应替换。
步骤 1：细胞铺板与毒素处理
- 将 SH-SY5Y 细胞接种到 6 孔 / 12 孔 / 24 孔板，过夜贴壁；
- 第二天更换为含不同浓度 MPP⁺ 或 6-OHDA 的培养基，例如：
- 对照组：不加毒素；
- 低剂量组：预实验选定的低浓度；
- 中剂量组、高剂量组：按预设梯度设置；
- 37 ℃、5% CO₂ 条件下孵育预定时间（如 6 h、24 h）。
建议同步留一部分孔用于 CCK-8 / LDH 检测，
方便在同一批次里评估“毒性强度 + ROS 变化”。
步骤 2：ROS 检测前的准备
在预定终点时间：
- 弃去各孔上清，可根据需要留样用于 LDH、MDA、GSH 等指标测定；
- 用无血清培养基或 PBS 轻柔洗 1 次，去除残留毒素和碎片。
步骤 3：KTB1910ROS活性氧试剂盒 中 DCFH-DA 的配制与探针装载
- 取出 KTB1910ROS活性氧试剂盒 中的DCFH-DA 储备液（10 mM）；
- 用无血清培养基稀释成工作液，建议从终浓度约 10 μM 起步；
- 37 ℃、避光孵育20–30 min，让探针充分进入细胞并被细胞内酯酶切割；
- 如果在预实验中发现：
- 阴性组背景偏高 → 可将终浓度降至2–5 μM，或将孵育时间缩短到 15–20 min；
- 信号偏弱 → 在细胞状态允许前提下，适当延长装载时间。
步骤 4：洗涤去除游离探针
- 探针装载结束后，弃去含 DCFH-DA 的培养基；
- 用无血清培养基 / PBS 轻柔洗涤1–2 次，尽可能去除细胞外未进入细胞的探针；
- 再加入适量无血清培养基，为上机检测做准备。
这一步对背景影响很大，建议不要省略，也不要过分用力吹打导致细胞大量脱落。
步骤 5：荧光显微或流式检测
荧光显微：
直接在板内观察；
使用与 FITC 接近的激发 / 发射通道；
建议先用毒性较重的一组（如高剂量 MPP⁺ / 6-OHDA）调节到不过曝的曝光时间，
然后固定该参数拍摄整个实验的所有组别。
流式细胞仪：
- 轻柔胰酶消化或刮起细胞，PBS 重悬；
- 以 488 nm 激发、FITC 通道检测 DCF 荧光；
- 在 FSC/SSC 门内排除碎片和死亡细胞，比较各组的平均荧光强度（MFI）或阳性细胞比例。
在有条件的情况下，可以设置一组H₂O₂ 阳性对照，用于验证 KTB1910ROS活性氧试剂盒 整体检测体系的灵敏度与动态范围。
四、怎么把 ROS 放进“神经毒性 / 神经保护”的整套 panel 里？
在神经毒性模型里，ROS 本身只是其中一个环节。
更有说服力的做法，是把它放在一条完整的证据链上。
1. ROS + 细胞活性 + 凋亡
- ROS：使用 KTB1910ROS活性氧试剂盒 进行 DCFH-DA 法检测；
- 活性：CCK-8 / MTT / LDH 释放；
- 凋亡：Annexin V / PI 流式、Caspase活性、Bcl-2/Bax 比值等。
可以在结果里呈现：
毒素处理 → ROS 明显升高 → 活性下降 / 凋亡增加；
保护剂预处理 → ROS 下降，同时活性恢复、凋亡减少。
这组指标组合，非常适合做“神经保护 / 抗氧化”类项目的主结果图。
2. ROS + 线粒体功能 + 氧化应激分子
在模型组中：
ROS 升高、线粒体膜电位下降、GSH 耗竭、MDA 升高，
再配合 KTB1910ROS活性氧试剂盒 提供的 ROS 数据，
可以把“氧化应激 + 线粒体损伤”这条线讲得很完整。
3. ROS + 信号通路（MAPK / JAK-STAT / NF-κB 等）
很多神经毒性和神经保护课题，都会关注 ROS 与信号通路之间的关系，例如：
- MPP⁺ / 6-OHDA 诱导的 ROS 升高，伴随 JNK/p38/ERK 等 MAPK 通路激活；
- ROS 上升后，NF-κB 或 STAT 通路被激活，引发炎症和细胞死亡相关基因表达变化。
此时，KTB1910ROS活性氧试剂盒 检测到的 ROS 变化可以作为上游信号，
下游搭配：
- 通路蛋白磷酸化（p-JNK、p-p38、p-ERK 等）；
- 转录因子核转位；
- 下游基因表达变化，
在讨论中就很容易串起“某候选药物通过减轻 ROS，进而调节某某通路，从而发挥神经保护作用”的逻辑链条。
五、神经毒性模型下做 ROS 时，常见的几个问题
1. 条件选错：要么“毒死光”，要么“看不出差别”
- 毒素条件太强 → 细胞大量死亡，ROS 信号变得杂乱，难以区分“活细胞内 ROS”与碎片背景；
- 条件太弱 → ROS、活性、凋亡都变化不明显，很难体现干预的效果。
建议：
必做预实验梯度：
- MPP⁺：2–3 个浓度 × 一个时间点（如 24 h）；
- 6-OHDA：2–3 个浓度 × 6 h / 24 h；
同一批次检测 CCK-8 + 形态，
找到“毒性适中”的组合，再固定下来做后续 panel。
2. 只设一个时间点，错过了动态过程
神经毒性通常是一个累积过程：
- 早期：ROS、通路信号变化明显；
- 中期：线粒体功能、抗氧化系统被破坏；
- 晚期：细胞死亡、结构损伤。
如果实验设计中只在 24 h 一个时间点上测 ROS，
有时会错过早期动态变化，难以判断“保护剂到底是在前期就起作用，还是只影响了最终存活”。
建议：
- 至少设置一个早期时间点（如 6 h）和一个终点时间点（如 24 h）；
- 早期侧重 ROS 与通路变化，晚期侧重凋亡与损伤终点。
3. DCFH-DA 使用不规范导致数据不稳定
典型问题包括：
- 探针浓度偏高或装载时间过长导致背景高；
- 装载后洗涤不干净；
- 显微曝光时间每组都不一样；
- 流式检测时，不同实验的“装载结束到上机时间”差异太大。
优化思路：
- 终浓度建议控制在2–10 μM 区间，装载时间控制在15–30 min 范围；
- 装载后认真洗涤 1–2 次，去除游离探针；
- 同一实验中，显微统一曝光参数，流式尽量统一装载到上机的时间间隔。
小结 & 提醒
在MPP⁺ / 6-OHDA 神经毒性模型中，
CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（KTB1910ROS活性氧试剂盒）可以提供一套相对标准化的细胞内 ROS 检测流程，
配合细胞活性、凋亡、线粒体功能，以及 GSH / SOD /MDA等氧化应激指标，
帮助你搭建起一条完整的「神经毒性 → 氧化应激 → 神经保护」证据链。
文中提到的毒素浓度、处理时间以及 DCFH-DA 的使用条件，
都属于基于公开文献和常见经验整理出的参考范围与预实验起点，
并不替代你对具体课题、具体细胞系的条件优化。
如果你也在做类似的神经毒性 ROS 实验，为了实验的严谨性，建议多方位参考文献和数据源，并结合自己细胞系做充分预实验；也欢迎在使用 CheKine™ 系列试剂盒前后，随时联系 Abbkine 技术支持，我们可以根据你的具体模型一起讨论更合适的参数和 panel 设计。
