Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒

自备耗材

• 离心机、荧光显微镜或流式细胞仪
• 可调节式移液枪及枪头、去离子水、载玻片
• 细胞培养孔板

试剂准备

注意：各组分开盖前，请先低速离心。

• 1×Annexin V Binding Buffer：临用前配置，用去离子水把 Annexin V Binding Buffer (5×)稀释成 1×Annexin V Binding Buffer；未用完的试剂 4℃可保存 6个月。
• Annexin V-FITC：即用型；使用前，平衡到室温；未用完的试剂分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。
• Propidium Iodide (PI)：即用型；使用前，平衡到室温；未用完的试剂分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。
• Apoptosis Inducer A：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
• Apoptosis Inducer B：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

实验步骤

一、细胞凋亡阳性诱导

1. 对于待诱导凋亡的培养细胞，分别按照与细胞培养液的体积比 1:1,000-1:3,000 的比例把 Apoptosis Inducer A 或 Apoptosis Inducer B加入到培养液中（也可将 Apoptosis Inducer A和 Apoptosis Inducer B同时加入培养液中）。
2. 在 4、8、12、16或 24 h后观察细胞凋亡的情况。通常 16-24 h后，在光学显微镜下可以看到明显的细胞形态的变化，此时可以用于细胞凋亡染色观察（不同细胞可按实际情况调整诱导浓度及诱导时间）。

二、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测

A. 流式细胞仪分析

1. 通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
2. 4℃，300 g离心 5 min收集 1-2×10⁵细胞，用冰预冷的 PBS洗涤 2次。

注意：贴壁细胞使用胰酶（不含 EDTA）消化后离心收集细胞，消化时间如果过长，易造成细胞膜结构损伤而出现细胞坏死的假阳性，所以需控制胰酶消化时间。

3. 用 500 µL 1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞。
4. 每 500 µL细胞悬液中加入 5 µL Annexin V-FITC和 2 µL PI，轻柔混匀。
5. 室温避光孵育 15 min。
6. 孵育结束后后置于冰上。染色后 30 min内通过流式细胞仪分析细胞。使用 488 nm和 535 nm激发，525 nm（FITC 通道）和 617 nm（PE或 PI通道）附近测量荧光。

B. 荧光显微镜分析

1. 对于悬浮细胞：

1. 1）按照步骤 A.1到步骤 A.6的流式细胞分析步骤。
2. 2）将步骤 A.6的细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞。尽快使用适当的滤镜通过荧光显微镜分析细胞（Annexin V- AbFluor™ 488可以使用 FITC设置拍照，PI可以使用 Cy®3或 Texas Red®设置拍照）。

2. 对于贴壁细胞，按照以下操作步骤：

1. 1）细胞接种于爬片或腔室载玻片上，培养细胞。
2. 2）通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
3. 3）除去培养基，用预热或者室温的 PBS洗涤细胞 2次。
4. 4）准备工作液：每 100 µL 1×Annexin V Binding Buffer添加 5 µL Annexin V-FITC和 2 µL PI，轻柔混匀。
5. 5）在细胞中加入适量的工作液（确保工作液完全覆盖细胞），室温避光孵育 15 min（可以在冰上孵育，以减缓凋亡过程，但孵育时间需延长到至少 30 min）。
6. 6）用 1×Annexin V Binding Buffer洗涤细胞 2次。

注意：此步不要使用 PBS洗涤细胞。

7. 7）载玻片上添加一滴 1×Annexin V Binding Buffer，然后将细胞爬片置于玻片上。对于细胞腔室载玻片上的细胞，添加足够的 1×Annexin V Binding Buffer覆盖细胞。

注意：也可使用抗荧光淬灭封片剂封片。

8. 8）使用适当的滤光片在荧光显微镜下分析细胞。