铁死亡模型中的ROS检测思路——以erastin/RSL3处理为例
铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁和脂质过氧化的程序性细胞死亡方式。特点包括：
- 细胞内谷胱甘肽（GSH）枯竭；
- 谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）失活或表达下降；
- 脂质过氧化物和活性氧（ROS）异常积累。
在体外实验中，常用erastin、RSL3 等小分子 诱导铁死亡，随后检测 ROS、水溶性/脂质过氧化指标以及相关蛋白表达，以确认铁死亡是否发生，评价保护剂或联合用药的作用。
基于 DCFH-DA 探针的CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法，KTB1910） 可用于检测铁死亡诱导过程中细胞内 ROS 的变化，作为铁死亡表型中的一环。
一、常见体外铁死亡模型与 ROS 的位置
1. 以 erastin 为代表的系统 Xc⁻ 抑制模型
erastin 通过抑制半胱氨酸/谷氨酸反向转运系统（system Xc⁻），导致：
- 细胞摄取半胱氨酸减少；
- 谷胱甘肽（GSH）合成受限，抗氧化能力下降；
- 在铁存在的情况下，脂质过氧化物和 ROS 累积，最终触发铁死亡。
在这类模型中，ROS 检测通常与以下指标配合：
- 细胞活性下降；
- GSH 含量下降；
- MDA 或其它脂质过氧化指标升高；
- GPX4 表达或活性下降。
2. 以 RSL3 为代表的 GPX4 抑制模型
RSL3 类化合物可直接抑制 GPX4 活性，使细胞无法有效清除脂质过氧化物，也会导致 ROS 积累和铁死亡。
在这类模型中，通常关注：
- RSL3 处理后 ROS 的变化；
- GPX4、SLC7A11 等蛋白的表达变化；
- 细胞死亡是否可被铁螯合剂（如 deferoxamine）或脂质过氧化抑制剂（如 ferrostatin-1）逆转。
在两类模型中，基于 DCFH-DA 的总 ROS 检测可以反映“铁死亡过程中的氧化应激程度”，与脂质过氧化和相关通路结果共同使用。
二、铁死亡模型中常用的细胞和诱导条件（参考范围）
不同细胞系对 iron overload 和 ferroptosis 诱导剂的敏感性不同，具体条件需要预实验优化，但常见情况大致如下（仅作为起始参考）：
肿瘤细胞（如 HT-1080、HepG2 等）：
erastin 处理数 μM 到十几 μM 级别、若干小时到 24 h 左右常能诱导明显的铁死亡表型；
RSL3 处理一般在亚 μM 到数 μM 范围 内进行探索。
其他细胞类型（如肾小管上皮细胞、心肌细胞等）：
具体敏感度差异较大，通常在低 μM 范围内进行梯度预实验，选出细胞活性下降明显但尚未大面积死亡的条件，再进一步检测 ROS 和其它指标。
在设计实验时，建议：
- 先用 CCK-8 或类似方法做一轮浓度–时间梯度，选出适宜的“铁死亡强度”；
- 在相同条件下再同时检测 ROS（KTB1910ROS活性氧试剂盒）、GSH、MDA、GPX4 等指标，构建整体表型。
三、在铁死亡模型中使用 KTB1910ROS活性氧试剂盒 检测 ROS：实验流程示例
以下以某肿瘤细胞系（如 HT-1080）为例，给出一个可以直接套用并按需微调的操作框架。
1. 细胞接种与铁死亡诱导
- 将细胞按合适密度接种于 6 孔 / 12 孔 / 24 孔板，过夜贴壁；
- 第二天更换为含不同浓度 erastin 或 RSL3 的培养基，例如：
- 阴性对照：不加诱导剂；
- 低剂量组、中剂量组、高剂量组：根据预实验选择浓度梯度；
- 37 ℃、5% CO₂ 条件下孵育预定时间（例如 12 h、24 h 等），具体时间点按预实验结果确定。
在同一批实验中，建议同步设置：
铁螯合剂（如 deferoxamine）或脂质过氧化抑制剂（如 ferrostatin-1）共孵育组，
以验证细胞死亡是否具有铁死亡特征。
2. ROS 检测前处理：弃上清与洗涤
在预设终点时间点：
- 弃去各孔培养基，上清可按需要留样用于检测 MDA、GSH 相关指标；
- 用无血清培养基或 PBS 轻柔洗 1 次，去除残留药物和碎片。
3. DCFH-DA 工作液的制备与装载
取出 KTB1910ROS活性氧试剂盒 试剂盒内的 DCFH-DA 储备液（10 mM）；
用无血清培养基稀释成工作液，常以约 10 μM 的细胞内终浓度 作为初始条件；
向每孔加入含 DCFH-DA 的工作液，37 ℃、避光孵育约 20–30 min；
如在预实验中发现阴性对照背景较高，可适当降低终浓度至 2–5 μM，或缩短装载时间；
若信号偏弱，可在细胞状态允许的前提下适当延长装载时间。
4. 洗涤去除游离探针
- 装载结束后，弃去含 DCFH-DA 的工作液；
- 用无血清培养基或 PBS 轻柔洗涤 1–2 次，尽量去除未进入细胞的游离探针；
- 再加入适量无血清培养基，为检测做准备。
这一环节对背景和信噪比影响较大，应尽量保证操作温和且洗涤充分。
5. 荧光检测：显微镜或流式
根据实验条件和设备情况，可选择：
- 荧光显微镜观察：
- 直接在培养板中观察；
- 使用与 FITC 类似的激发/发射通道；
- 建议先用诱导程度较高的一组调节到不过曝的曝光参数，再统一用于本实验其他组别。
- 流式细胞仪检测：
- 轻柔胰酶消化或刮起细胞，PBS 重悬；
- 以 488 nm 激发，FITC 通道检测荧光；
- 在 FSC/SSC 门内排除碎片和死亡细胞，比较不同处理组之间的平均荧光强度或阳性细胞比例。
在条件允许的情况下，可以设置一组短时间 H₂O₂ 处理的阳性对照，用于验证整体 ROS 检测体系的灵敏性。
四、铁死亡模型中 ROS 指标与其它 readout 的组合
在铁死亡研究中，单独检测 ROS 往往不足以支撑完整结论。常见的组合思路包括：
1. ROS + GSH + GPX4
通过三者的联合变化，可以构建“GSH 耗竭 → GPX4 功能受损 → ROS 和脂质过氧化积累”的路径。
2. ROS + MDA / 其它脂质过氧化指标
- MDA：使用相应试剂盒检测细胞或组织中的 MDA 含量；
- 其它脂质过氧化 readout：例如特异性的脂质 ROS 探针。
这类指标更直接反映脂质过氧化的程度，与 ROS 检测一起，更有利于区分一般氧化应激和铁死亡相关的脂质过氧化。
3. ROS + 细胞活性 / 细胞死亡方式判定
如果在 erastin 或 RSL3 处理下，细胞活性下降、ROS 和 MDA 升高，而铁螯合剂或脂质过氧化抑制剂能够明显逆转这些变化，就能对铁死亡的参与提供更有力的支持。
五、铁死亡模型下做 ROS 实验时的常见问题与建议
1. 诱导条件过强或过弱
- 条件过强：细胞在较短时间内大量死亡，ROS 信号可能不稳定或难以解读；
- 条件过弱：ROS 和其它指标变化不明显，不利于评价干预效果。
建议通过浓度–时间梯度预实验，优先选取“损伤明显但未完全崩溃”的条件，再进行系统检测。
2. 未区分总 ROS 与脂质 ROS
DCFH-DA 更偏向反映细胞内总 ROS 水平，不能直接区分脂质过氧化与其它类型 ROS。在需要更精确区分脂质 ROS 时，可以在 KTB1910ROS活性氧试剂盒 的基础上增加专门探针或指标。
3. DCFH-DA 使用不规范导致数据波动
主要表现为阴性背景高、重复性差，常见原因包括：
- 探针浓度过高、孵育时间过长；
- 装载后洗涤不充分；
- 不同实验间显微曝光或上机时间差异较大。
可以通过降低终浓度、缩短装载时间、固定显微曝光参数、统一装载到检测的时间间隔等方式来改善。
小结与提示
在铁死亡模型中，基于 DCFH-DA 的 CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（KTB1910ROS活性氧试剂盒）可用于评估细胞内 ROS 水平的变化，与 GSH、MDA、GPX4 等指标共同构成铁死亡表型的一部分。
文中提到的诱导剂浓度、处理时间及 DCFH-DA 使用条件，主要基于常见实验经验和公开资料整理，适合作为预实验起点，并不替代针对具体细胞系和课题的条件优化。
如果实验设计中涉及类似的铁死亡模型，为了保持结果的可靠性和可重复性，建议结合最新文献、预实验结果以及多维度指标进行综合判断；在使用 CheKine™ 系列试剂盒的过程中，如需进一步讨论实验条件或结果解读，可联系 Abbkine 技术支持团队获取更具体的建议。
