LPS诱导RAW264.7/THP-1炎症模型：用KTB1910活性氧试剂盒稳定检测巨噬细胞ROS

在炎症和免疫相关课题里，

“LPS 刺激 RAW264.7 / THP-1，检测 ROS、NO、细胞因子”

几乎是最常见的一类体外模型：

• 想看巨噬细胞 / 单核细胞被 LPS 激活到什么程度；

• 想评价某个天然产物、纳米材料或小分子，是否能抑制 LPS 诱导的氧化应激和炎症反应；

• 想在文章里呈现一条比较完整的链条：

  LPS → ROS ↑ → NF-κB/MAPK 激活 → TNF-α/IL-6/NO ↑ …

这篇文章，结合CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法，KTB1910），整理出一套相对稳定、能“照着搭”的 LPS 炎症模型 + ROS 检测思路，方便你落到具体实验里。

一、LPS + ROS：巨噬细胞炎症模型里，ROS 在哪一环？

在 LPS 诱导的炎症模型中（尤其是 RAW264.7、THP-1），ROS 通常扮演两类角色：

1. 炎症激活强度的 readout
• LPS 通过 TLR4 信号通路激活巨噬细胞，诱导 ROS 生成；
• ROS 反过来又参与 NF-κB、MAPK 等通路的激活，促进 TNF-α、IL-6、NO 等产物释放。
2. 药物 / 材料抗炎作用的评价指标
• 很多工作会用 DCFH-DA 测定 LPS 诱导的细胞内 ROS，
• 再看“某化合物/提取物/纳米粒子”能否显著降低 ROS 信号，从而解释其抗氧化、抗炎作用。

因此在这类实验设计中，KTB1910活性氧ROS试剂盒 可以被看作“炎症模块”里的 ROS readout 工具，通常与 NO、细胞因子、iNOS 等指标一起出现。

二、两类典型细胞模型

围绕 LPS + ROS，可以重点考虑两类模型：

1. RAW264.7 小鼠巨噬细胞

应用场景：

• 经典的 M1 型炎症模型；
• 评价多种抗炎成分（多酚、黄酮、多糖、纳米材料等）的抑制效果。

2. THP-1 人单核细胞 / 巨噬细胞

应用场景：

• 更贴近人源免疫细胞；
• 适合做免疫毒性、环境暴露、药物免疫副作用等方向。

后面所有流程，你可以在 RAW264.7 / THP-1 间平移使用，只是对 LPS 浓度、刺激时间做一点微调。

三、LPS 诱导条件：浓度和时间选在哪个“区间”比较稳？

1. LPS 浓度：100 ng/mL – 1 μg/mL 是常用工作区

文献和经验里，RAW264.7 细胞常用的 LPS 浓度范围大约在 100 ng/mL–1 μg/mL：

• 一些研究直接用1 μg/mL LPS 处理 18–24 h，可稳定诱导炎症因子与 ROS 升高；
• 也有课题组在 10、100、1000 ng/mL 间做梯度，发现 1 μg/mL 的效应最明显且细胞仍能耐受。

对 THP-1 来说，量级也大致在这个区间，只是有些课题会更偏向 100 ng/mL 左右起步。

建议：初次在自己实验室搭 LPS 模型时，不要“一口吃死”一个浓度， 可以直接做一个小梯度（100 / 500 / 1000 ng/mL），

一次性摸清对自己这批细胞来说“既有明显激活又不至于毒死”的范围。

2. 刺激时间：急性信号 vs 慢性激活

LPS 激活巨噬细胞时，早期是信号通路磷酸化、ROS 短时升高；中后期是因子分泌、酶表达变化。

常见搭配：

• 早期（15–60 min）：
• 看 NF-κB、MAPK 磷酸化，
• 或者快速 ROS 峰（尤其是搭配 PMA 时的呼吸爆发模型）。
• 中期（4–8 h）：
• ROS 明显升高；
• 某些细胞因子 mRNA、iNOS 表达已开始变化。
• 晚期（18–24 h）：
• 炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）、NO 等释放达到较高水平；
• 很多研究会在此时检测 DCFH-DA ROS 信号，配合细胞因子和 NO 读数。

第一次搭模型时，可以直接选18–24 h作为 LPS 处理时间， 再在这个时间点上做 KTB1910活性氧ROS试剂盒 细胞 ROS 检测，

后续再视课题需要增加更早/更晚时间点。

四、用 KTB1910活性氧ROS试剂盒 在 LPS 模型中检测 ROS：一个 “RAW264.7 模板”

下面流程以 RAW264.7 + LPS 炎症模型为例写一版 SOP，你可以按需替换成 THP-1 等其它细胞。

步骤 1：细胞铺板与 LPS 处理

1. RAW264.7 细胞常规培养至对数生长期；
2. 96 孔 / 24 孔板按合适密度铺板，过夜贴壁；
3. 次日更换为含不同浓度 LPS 的培养基，例如：
• 阴性对照：0 ng/mL；
• LPS 低剂量：100 ng/mL；
• LPS 中剂量：500 ng/mL；
• LPS 高频使用剂量：1 μg/mL；
4. 37 ℃、5% CO₂ 培养18–24 h，作为标准炎症激活时间点。

步骤 2：ROS检测前处理

在预设时间点（如处理 24 h）：

1. 轻轻弃去各孔上清，可部分留样用于后续 NO、细胞因子检测；
2. 用无血清培养基或 PBS 轻柔洗 1 次，去掉残余 LPS 和悬浮细胞碎片。

步骤 3：KTB1910活性氧ROS试剂盒 DCFH-DA 工作液配置与装载

1. 取出 KTB1910活性氧ROS试剂盒 中的 DCFH-DA 储备液（10 mM），用无血清培养基按一定比例配制工作液；
2. 初次使用可按10 μM 终浓度 + 30 min 装载 作为起步条件（与大量文献中的 DCFH-DA 操作一致）。
3. 每孔加入适量 DCFH-DA 工作液，置 37 ℃、避光孵育约 20–30 min；
4. 如发现信号偏弱可延长装载时间，背景偏高则可将终浓度降至 2–5 μM 或缩短孵育时间（具体可通过预实验优化）。

步骤 4：洗涤和检测

装载结束后：

1. 弃去含探针的培养基；
2. 用无血清培养基或 PBS 洗 1–2 次，去除游离 DCFH-DA；
3. 再加入适量无血清培养基，根据读数方式选择：

• 流式细胞仪：
• 轻柔吹打或短暂胰酶消化收集细胞，PBS 重悬；
• 以 488 nm 激发、FITC 通道分析 DCF 荧光强度，对比各组平均荧光（MFI）或阳性率。
• 荧光显微镜：
• 直接在板内观察，使用 FITC 通道成像；
• 建议先用 LPS 高剂量组调好不过曝的曝光时间，然后固定该参数拍摄整板样本，便于后续比较。

同时可以设置一组 H₂O₂ 阳性对照（例如不加 LPS，仅在测定前短时间给予适当浓度 H₂O₂），用于验证 KTB1910活性氧ROS试剂盒 检测体系总体反应是否灵敏。

五、把 ROS 放进「LPS 炎症 panel」里：几种常见搭配

在 LPS 模型里，ROS 通常不会单独出现，而是作为整套炎症 panel 中的一个维度。可以参考下面几种组合方式来设计实验：

1. ROS + NO + 细胞因子（经典炎症三件套）

• ROS：使用 KTB1910活性氧ROS试剂盒 检测细胞内 ROS；
• NO：利用 Griess 法或相关试剂盒检测培养上清中的 NO 水平；
• TNF-α / IL-6 / IL-1β：ELISA 或 qPCR 测定。

这样可以在一张图里同时呈现：

LPS 处理 → ROS 明显升高 → NO 和炎症因子升高 → 某抗炎处理可同时下调上述指标。

非常适合做“抗炎 / 抗氧化”类候选药物评估。

2. ROS + iNOS / COX-2 + 通路（NF-κB / MAPK）

• 上游：KTB1910活性氧ROS试剂盒 看 ROS，Western blot 看 p-p65 / p-p38 / p-ERK 等信号通路激活；
• 中游：iNOS、COX-2 等蛋白表达水平；
• 下游：NO 释放和炎症因子变化。

这种组合在机制类文章中比较常见，逻辑清晰，也更容易在讨论部分解释“某药通过降低 ROS，从而抑制 NF-κB 激活和 iNOS/COX-2 上调”。

3. ROS + 吞噬 / 呼吸爆发功能 readout

在一些功能性研究中，还会将 ROS 和吞噬功能、呼吸爆发能力挂钩：

• 例如用 PMA 作为刺激，短时间内观察中性粒细胞或部分巨噬细胞的氧化突发（respiratory burst）；
• 利用 DCFH-DA 流式或荧光读数来定量呼吸爆发程度。

如果你做的是“增强/抑制先天免疫功能”的课题，可以考虑在 LPS 模型之外，额外接一个 PMA 呼吸爆发功能实验，更好地说明 ROS 与细胞功能之间的关系。

六、LPS + ROS 实验中常见的小问题与排查思路

1. ROS 信号不明显，LPS 像是“没起作用”

可能原因包括：

• LPS 浓度过低（例如只有几 ng/mL，在某些细胞里不足以明显诱导 ROS）；
• 处理时间太短，仅 1–2 h，还未出现稳定 ROS 升高；
• 细胞密度过高或状态不佳。

排查思路：

1. 首先确认细胞状态和密度；
2. 把 LPS 调整到 100–1000 ng/mL 区间；
3. 时间点从 18–24 h 入手做一轮完整检测。

2. 背景很高，阴性组也很亮

优先排查 DCFH-DA 使用问题：

• 探针终浓度是否过高（例如直接用 10 μM，细胞本身背景就偏高）；
• 装载时间是否过长（>30 min）；
• 装载后洗涤是否充分；
• 显微时曝光是否统一。

可以先将终浓度降至2–5 μM，装载时间控制在15–20 min，同时注意认真洗探针，一般能明显改善背景。

3. 流式数据重复性不好

常见原因：

• 实验批次间细胞密度差异大；
• 不同批次使用了不同试剂盒批号或混用组分；
• 装载完成到上机检测的间隔时间差异大。

建议：

• 一次实验尽量用同一批号的 KTB1910活性氧ROS试剂盒；
• 统一细胞铺板密度和处理时间；
• 采用“分批装载 + 及时上机”的节奏，尽量缩短并统一装载到检测之间的时间。

小结与提醒

在LPS 诱导 RAW264.7 / THP-1 炎症模型中，

KTB1910活性氧ROS试剂盒 可以很自然地作为：

「巨噬细胞炎症激活模块」中的 ROS readout 工具，

配合 NO、炎症因子、iNOS/NF-κB 等指标，

搭出一套既有信号通路、又有功能 readout 的完整 panel。

文中提到的 LPS 浓度、处理时间和 DCFH-DA 使用条件，

大多来源于公开文献常用设置和日常经验，仅作为参考区间和预实验起点，

并不等同于对任何特定细胞系的唯一“标准条件”。

如果你也准备在巨噬细胞中做 LPS + ROS 或类似炎症模型，为了实验设计的严谨性，建议结合最新文献、自己细胞系的预实验结果进行综合判断；也欢迎在使用 CheKine™ 相关试剂盒前后，随时联系 Abbkine 技术支持，我们可以根据你的具体模型一起讨论更合适的参数和 panel 组合。