谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 恒温箱
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Substrate：临用前配制，Substrate加入 20 mL Assay Buffer，充分溶解；未用完的试剂分装避光于-20℃保存 1个月。
• GR：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Working H2O2：临用前配制，吸取 21.5 μL H2O2加入 5 mL去离子水，充分混匀，配制好的试剂当天使用；4℃避光保存。
• Working Reagent：临用前配制，根据样本数量，按照 2 mLWorking Substrate加入 1 μL GR 的比例配制，再加 6 mL的 Assay Buffer混匀（当天用完）；Working Regent在 25℃（其他物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热 30 min以上。

样本制备

1. 组织样本：用冷的 PBS清洗组织，尽可能去除血液。吸干组织上的水分，称重。称取 0.1 g组织样本，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 血清（浆）：直接测定（如需要可用生理盐水稀释不同倍数）。
3. 细胞、细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Regent于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 30 min。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中按照如下方式加样：

4. 充分混匀，空白孔在 340 nm处第 10 s和第 10 min 10 s的吸光值，分别记为 A1，A2，测定孔在 340 nm处第 10 s和第 10 min 10 s的吸光值，分别记为 A3，A4，计算ΔA 空=A1 -A2，ΔA 测=A3-A4。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下：

1. 按蛋白浓度计算

GSH-Px 活力单位定义：在 25℃或 37℃温度下，每毫克蛋白每分钟催化 1 nmol NADPH 氧化。

GSH-Px (U/mg prot)=321.6×(ΔA 测-ΔA 空)÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

GSH-Px 活力单位定义：在 25℃或 37℃温度下，每克样品每分钟催化 1 nmol NADPH氧化。

GSH-Px (U/g 鲜重)=321.6×(ΔA 测-ΔA 空)÷W

3. 按细胞或细菌数量计算

GSH-Px 活力单位定义：在 25℃或 37℃温度下，每 104个细胞或细菌每分钟催化 1 nmol NADPH 氧化。

GSH-Px(U/104)=321.6×(ΔA 测-ΔA 空)÷500

4. 按液体体积计算

活性单位定义：在 25℃或 37℃温度下，每毫升液体每分钟催化 1 nmol NADPH氧化。

GSH-Px(U/mL)=321.6×(ΔA 测-ΔA 空)

ΔA 空=A1 -A2，ΔA 测=A3-A4；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV 板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，200 μL=2×10^-4 L；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W：样品质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20 μL =2×10^-2 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；500：细胞或细菌数量，500万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。