药物毒性模型中的ROS检测思路——以顺铂肾毒性与阿霉素心肌毒性为例
多种经典化疗药物在发挥抗肿瘤作用的同时，会对肾脏、心脏等器官产生明显毒性。 在顺铂肾毒性、阿霉素心肌毒性等模型中，氧化应激和 ROS 过量被认为是重要的病理机制之一。
体外实验中，常见做法是在相关细胞系中建立药物毒性模型：
- 顺铂（cisplatin）作用于肾小管上皮细胞，模拟肾毒性；
- 阿霉素（doxorubicin）作用于心肌细胞或心肌细胞样细胞，模拟心肌毒性。
然后通过检测 ROS、细胞活性、凋亡及损伤标志物，评价药物本身的毒性强度以及候选保护剂的干预效果。 基于 DCFH-DA 探针的CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法，KTB1910） 可用于这些模型中细胞内 ROS 水平的检测。
一、顺铂肾毒性模型中的 ROS 检测思路（以 HK-2 为例）
1. 模型建立：浓度与时间（参考范围）
顺铂体外肾毒性模型常用细胞包括：
- 人肾近曲小管上皮细胞HK-2；
- 大鼠肾小管上皮细胞等。
常见研究中，顺铂在体外的使用条件大致处于以下范围（具体需通过预实验优化）：
- 浓度：约 5–40 μM；
- 处理时间：24–48 h 之间较常见。
通常做法是：
先通过 CCK-8 或类似方法做一轮浓度–时间梯度，
在“细胞活性下降明显但并未完全失活”的条件下，再进行 ROS 与其它指标的检测。
2. 实验流程示例：顺铂 + KTB1910活性氧ROS试剂盒
以下以 HK-2 细胞为示例。
（1）细胞接种与顺铂处理
- 将 HK-2 细胞接种于 6 孔、12 孔或 24 孔板，过夜贴壁；
- 第二天配制含不同浓度顺铂的培养基，例如：
- 对照组：不加顺铂；
- 低剂量组：预实验选定的低浓度（如 5–10 μM）；
- 中剂量组、高剂量组：逐步递增浓度（如 20 μM、40 μM 等）；
- 置于 37 ℃、5% CO₂ 培养箱处理预定时间（如 24 h 或 48 h）。
建议在同一批实验中保留部分孔，用于活性检测（如 CCK-8）或 LDH 释放分析，以综合评估毒性强度。
（2）ROS 检测前处理
在预设终点时间：
- 弃去各孔培养基，上清可留作后续其它指标检测（如 LDH、MDA）；
- 用无血清培养基或 PBS 轻柔洗涤 1 次，去除残留顺铂及脱落细胞。
（3）KTB1910活性氧ROS试剂盒 中 DCFH-DA 的装载
取出 KTB1910活性氧ROS试剂盒 内的 DCFH-DA 储备液（10 mM）；
用无血清培养基稀释，制备 DCFH-DA 工作液；
初始条件可参考：
- 目标终浓度约10 μM；
- 37 ℃、避光孵育约 20–30 min。
若在预实验中发现阴性组背景偏高，可将终浓度降低至 2–5 μM，或将孵育时间缩短至 15–20 min；
若信号较弱，则在细胞状态允许前提下适当延长装载时间。
（4）洗涤去除游离探针
- 装载结束后，弃去含 DCFH-DA 的工作液；
- 用无血清培养基或 PBS 轻柔洗涤 1–2 次，尽可能去除细胞外探针；
- 再加入适量无血清培养基，备用。
（5）荧光检测
- 荧光显微镜：
- 在板内直接观察，选择与 FITC 接近的激发/发射通道；
- 使用顺铂高剂量组调整合适曝光时间，随后在同一实验中对所有组别使用统一曝光参数。
- 流式细胞仪：
- 轻柔胰酶消化或刮起细胞，PBS 重悬；
- 以 488 nm 激发、FITC 通道检测；
- 在 FSC/SSC 门内排除碎片和死亡细胞，比较不同处理组的平均荧光强度或阳性细胞比例。
在条件允许的情况下，可增加短时间 H₂O₂ 处理作为阳性对照，用于评估整体检测体系的灵敏性。
3. 与其它指标的组合
在顺铂肾毒性模型中，ROS 指标通常与以下 readout 联合使用：
这样的组合有助于构建一条较完整的路径：
顺铂处理 → ROS 升高和抗氧化防御受损 → 凋亡/坏死增强 → 肾小管细胞功能受损。
二、阿霉素心肌毒性模型中的 ROS 检测思路（以 H9c2 为例）
1. 模型建立：细胞与条件（参考范围）
阿霉素心肌毒性模型常用细胞包括：
- 大鼠心肌细胞样细胞系H9c2；
- 某些研究中也使用原代心肌细胞。
在 H9c2 中，阿霉素体外处理的条件通常在以下范围内探索：
- 浓度：约 0.5–5 μM；
- 处理时间：24–48 h 较常见。
具体浓度–时间的选择，应结合预实验结果及细胞状态，
优先选择既能观察到明显毒性和 ROS 升高，又不会导致完全失活的条件。
2. 实验流程示例：阿霉素 + KTB1910活性氧ROS试剂盒
（1）细胞接种与阿霉素处理
- 将 H9c2 细胞按适当密度接种于多孔板，过夜贴壁；
- 次日配制含不同浓度阿霉素的培养基，例如：
- 对照组：不加阿霉素；
- 低剂量组：如 0.5–1 μM；
- 中剂量组、高剂量组：如 2–5 μM；
- 于 37 ℃、5% CO₂ 条件下孵育预定时间（如 24 h 或 48 h）。
同样建议预留部分孔，用于后续 CCK-8、LDH 等活性或损伤检测。
（2）ROS 检测前处理与 DCFH-DA 装载
步骤与前述顺铂模型类似：
- 到达终点时间后，弃去培养基，轻柔洗涤 1 次；
- 以无血清培养基配制 DCFH-DA 工作液，初始条件可设为终浓度约 10 μM，37 ℃ 避光孵育 20–30 min；
- 装载后洗涤 1–2 次，去除游离探针；
- 加入无血清培养基，使用荧光显微镜或流式细胞仪检测细胞内 ROS 信号。
在进行方法优化时，可根据背景和信号强度调整 DCFH-DA 终浓度与装载时间。
3. ROS 在阿霉素心肌毒性 panel 中的位置
在阿霉素心肌毒性研究中，ROS 常与下列指标一起参与结果解读：
- 心肌细胞损伤指标：LDH 释放、细胞活性下降；
- 线粒体功能：膜电位变化等；
- 凋亡指标：Caspase 活性、Bcl-2/Bax 比值、Annexin V / PI 等；
- 氧化应激防御系统：SOD、GSH-Px 活性，GSH 含量，MDA 水平等。
ROS 检测结果可用于说明阿霉素诱导心肌毒性的氧化应激成分，并与各种抗氧化/心肌保护干预的效果进行对比。
三、顺铂与阿霉素模型中的共性注意事项
1. 药物条件需经过充分预实验
不同实验室、不同细胞系对顺铂和阿霉素的敏感性存在差异。
建议通过浓度–时间梯度预实验，综合细胞活性、形态观察和初步 ROS 结果，
选择具备代表性的模型条件后，再进行系统研究。
2. DCFH-DA 使用时的常见问题与优化方向
阴性背景较高：
通常可通过降低 DCFH-DA 终浓度、缩短装载时间、加强洗涤等方式改善；
重复性不足：
需尽量统一细胞接种密度、药物处理时间、探针装载时间及显微曝光/上机时间间隔；
探针装载后到检测的间隔过长：
建议缩短并统一装载结束到检测的时间，减少因氧化还原状态持续变化带来的偏差。
3. 单一指标不足以支持结论
无论是顺铂肾毒性还是阿霉素心肌毒性，
均建议将 ROS 检测结果与：
- 细胞活性/损伤；
- 凋亡或坏死；
- 氧化应激相关指标；
等数据结合分析，以形成更完整的毒性与保护机制图景。
小结与提示
在顺铂肾毒性和阿霉素心肌毒性等药物毒性模型中，
CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法，KTB1910）
可以为细胞内 ROS 变化提供一套相对标准化的检测流程。
配合细胞活性、凋亡、线粒体功能以及 GSH、SOD、MDA 等指标，
有助于建立“药物处理 → 氧化应激 → 细胞损伤/保护”的完整实验链条。
文中涉及的药物浓度、处理时间以及 DCFH-DA 使用条件，
均属于基于常见实践整理的参考范围，更适合作为预实验起点，
并不替代针对具体课题与细胞系的条件优化。
如果需要开展类似的药物毒性 + ROS 实验，为了保证结果的严谨性，建议综合查阅最新文献、结合自身预实验数据进行判断；在使用 CheKine™ 系列试剂盒的过程中，如需针对具体模型进一步讨论实验条件或结果解读，可联系 Abbkine 技术支持团队获取更详细的技术服务。
