β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 550 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Working Reagent I：临用前配制；48 T加入 1.1 mL去离子水，96 T加入 2.2 mL去离子水，充分溶解；用不完的试剂 4℃避光保存 4周。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：Reagent II 有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Stardard：临用前配制；加入 1 mL去离子水溶解，配制成 10 mg/mL葡萄糖溶液备用，4℃保存 2周。

标准品制备：使用 10 mg/mL葡萄糖标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 细菌和细胞：收集 500万细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 550 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

充分混匀，放入 37℃水浴 60 min

3. 充分混匀，沸水浴 5 min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，取 200 μL至微量玻璃比色皿或 96 孔板中，记录 550 nm处吸光值，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定，对照孔记为 A 对照。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.2 mg/mL的，ΔA 标准样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x(mg/mL)。

2. β-1,3-GA活性的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时产生 1 mg还原糖定义为一个酶活力单位。

β-1,3-GA(U/mg prot)=(x×V 样)÷(V 样×Cpr)÷T=x÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克组织每小时产生 1 mg还原糖定义为一个酶活力单位。

β-1,3-GA(U/g 鲜重)=(x×V 样)÷(V 样÷V 提×W)÷T=x÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

酶活单位定义：每 104个细菌或细胞每小时产生 1 mg还原糖定义为一个酶活力单位。

β-1,3-GA(U/104 cell)=(x×V 样)÷(V 样÷V 提×500)÷T=0.002×x

（4）按样本体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体每小时产生 1 mg还原糖定义为一个酶活力单位。

β-1,3-GA(U/mL)=[x×V 样]÷V 样÷T=x

V 样：加入反应体系中样本体积，0.035 mL；V 提：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，60 min=1 h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞数量，500万。