乳酸检测试剂盒操作步骤：96孔板SOP与孔位设计（WST-8比色法）
本文是《乳酸含量检测应用指南（科研）》系列之一： 完整流程请见：乳酸含量检测应用指南（科研）
这篇只解决一件事：拿到 乳酸检测试剂盒，用 96 孔板怎么一步步操作，孔位怎么排最顺手。
下面的 SOP 是按说明书写的，但会多加一些“人话”提示，方便你直接照做。
一、实验前准备：设备 & 试剂状态
- 确认仪器
- 酶标仪可在450 nm波长读板，提前预热至少 30 min。
- 确认试剂是否解冻到位
- Lactate Assay Buffer：4℃保存，使用前平衡到室温。
- LDH、Cofactor、WST-8、Enhancer、标准品等：-20℃保存，使用前按说明书解冻，混匀后再用。
- 确认样本准备好
- 组织、细胞等样本按说明书做匀浆/裂解、离心，取上清备用。
- 血清/血浆、其他体液可直接上板检测。
延伸阅读：乳酸标准曲线怎么配（0.03–2 mM）
二、孔位怎么排：一板典型布局示例
先定一个“常用场景”：
- 你有40 个样本，每个做2 个重复孔；
- 标准曲线 8 个点（含空白），每个做 1 个孔；
- 刚好能在一块 96 孔板上跑完（40×2 + 8 = 88 孔）。
1）简化版排法（横着看）
- 第 1 列：S0–S7（8 个标准点，含空白），从 A1 到 H1
- 第 2–5 列：样本 1–16，每个 2 孔
- 第 6–9 列：样本 17–32，每个 2 孔
- 第 10–11 列：样本 33–40，每个 2 孔
- 第 12 列：预留给对照/空白/疑难样本（看你自己实验设计）
你也可以改成：
- 标准曲线做 2 孔重复（占 16 孔），
- 样本数量相应减少一点（比如 32 个样本 × 2 孔 = 64 孔），总共 80 孔左右。
2）给自己留 1–2 行“机动行”
建议习惯性保留一整行（比如 H 行）做：
- 额外样本
- 重复实验（某个孔读数有问题时补做）
- 空白/背景/对照（比如无 LDH 背景孔）
核心原则：标准孔集中放在一两列，样本按顺序排，保证你以后看数据表格时一眼就知道谁是谁。
三、标准品与工作液配制（按孔数算用量）
3.1 标准品浓度梯度（概要）
说明书建议用 100 mM 标准品先配成 2 mM 储备液，再配出 2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mM 等 7 个浓度，以 Buffer 作为空白。
延伸阅读：乳酸标准曲线怎么配（0.03–2 mM）
在本 SOP 里，你只要记住：标准曲线至少 1 条，建议每板都做。
3.2 Working Reagent 工作液：按孔数算量
说明书原话：
“每孔需要 50 μL Working Reagent，为避免损失，按 55 μL 每单孔体系配制：31 μL Lactate Assay Buffer、8 μL Cofactor、5 μL WST-8、1 μL Enhancer、10 μL Lactate Dehydrogenase，混匀，现配现用。”
公式：
- 需配工作液总量（μL） = 55 μL × 需要加工作液的孔数 N
- 各组分体积 = 55×N ×（该组分在 55 μL 里的比例）
套用说明书给的比例（31 / 8 / 5 / 1 / 10），你可以这么算：
假设这块板你打算用80 个孔（含标准+样本+空白）， 工作液总量 = 55 × 80 = 4400 μL = 4.4 mL
各组分用量约为：
- Lactate Assay Buffer：31/55 × 4.4 mL ≈ 2.48 mL
- Cofactor：8/55 × 4.4 mL ≈ 0.64 mL
- WST-8：5/55 × 4.4 mL ≈ 0.40 mL
- Enhancer：1/55 × 4.4 mL ≈ 0.08 mL
- LDH：10/55 × 4.4 mL ≈ 0.80 mL
实操小建议：
- 可以按N×55 μL 再乘 1.05–1.1 的量配，给移液损失预留一点余量；
- 所有组分混好后，轻轻颠倒混匀，不要剧烈起泡；
- 工作液配好后尽量一次性用完，避免放太久背景慢慢升高。
四、操作步骤：上样到孵育
下面是按照说明书整理的 96 孔板 SOP，步骤不复杂，关键是节奏统一。
Step 1 酶标仪准备
- 提前打开酶标仪，预热 30 min 以上；
- 选择450 nm 波长。
Step 2 配工作液
- 按上一节的公式，根据这板实际用到的孔数 N 计算所需总量；
- 依次加入：Assay Buffer → Cofactor → WST-8 → Enhancer → LDH；
- 混匀后，暂时置冰上或室温（视说明书要求而定），尽量在短时间内用完。
Step 3 配检测体系（上板）
按照说明书推荐的体系：
| 试剂 | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） |
|---|---|---|
| 样本 | 0 | 50 |
| 标准品工作液 | 50 | 0 |
| Working Reagent | 50 | 50 |
操作顺序建议：
- 按孔位设计，把标准品工作液/样本 先加到对应孔（建议从左到右、一列一列来）；
- 最后统一用多道排枪加入 Working Reagent；
- 每加完一列，轻轻敲击板边或用摇床短暂震荡，让液体混匀、无气泡。
小技巧：
- 可以先只加样本/标准，全部加完后再开始计时加工作液，这样所有孔的反应起点更接近。
- 如果发现孔里气泡较多，读板前可以用干净吸头轻轻挑破。
五、孵育与读板
- 全板混匀后，将板放入 37℃ 恒温箱或酶标仪孵育模块中，37℃ 避光孵育 30 min。
- 孵育结束后，立即在酶标仪上于450 nm 读取各孔吸光度：
- 记录 A空白、A标准、A测定。
提醒一句：
- 不要孵过头，也不要孵到一半才想起来读板，时间太散会引入额外误差；
- 建议自己设个定时器（手机/仪器），孵育时间到就立刻读。
六、数据处理与记录小提示
详细计算说明书已经给出了：先算 ΔA，再根据标准曲线求浓度，按需要乘稀释倍数并做归一化。
在 SOP 这篇里，我们只给几个“操作层”的提醒：
- 每板建一个 Excel 模板
- 把孔位布局、标准浓度、稀释倍数都写好，直接填 A 值就能算；
- 你也可以配合官网的“在线计算器小工具”一起用。
- 记录好样本/孔位对应关系
- 建议打印一张 96 孔板布局表，写清每个孔对应哪个样本、哪种处理；
- 以后翻数据，看到某个异常孔就能迅速回溯。
- 标记异常孔
- 比如移液明显出错、孔里有明显污染或气泡没破，直接在原始记录上标出来，后续计算可以剔除或补做。
延伸阅读：乳酸检测A值异常排查清单
七、小结：把板子排顺、节奏统一，实验就稳一半
这套 96 孔板 SOP 核心就两句话：
- 孔位设计要顺手：标准集中放、样本顺序排、留一行机动孔；
- 操作节奏要统一：工作液一次配齐、上板有顺序、孵育和读板尽量“齐步走”。
只要这两点做到位，同样一块 CheKine™ 乳酸检测试剂盒，你能跑出来的结果会明显更稳定、重复性更好。
