乳酸标准曲线怎么配：0.03–2 mM稀释表 + 计算模板（WST-8比色法）
本文是《乳酸含量检测应用指南（科研）》系列之一， 完整流程请见：乳酸含量检测应用指南（科研）
很多人做乳酸实验，操作步骤没问题，卡在两件事：
- 标准曲线到底配到多少浓度合适？
- Excel 里公式怎么写才省事、又不容易算错？
下面这篇就按你在实验台上的操作顺序，带你把0.03–2 mM 标曲 彻底走一遍。
一、先定范围：为什么是 0.03–2 mM？
这个试剂盒的线性检测范围本身就是0.03–2 mM，灵敏度 0.03 mM。
也就是说：
- 标曲配到 2 mM，是为了覆盖高浓度样本（稀释后还能落在曲线里）；
- 最低到 0.03 mM，是为了给低浓度样本一个还算靠谱的读数区间。
你板上的样本，无论原始浓度多高多低，都可以通过“预估 + 稀释”往这条曲线上靠。
二、原始标准品和基本思路
说明书给的是：
- L(+)-Lactate Standard (100 mM)，使用前平衡到室温，分装 -20℃ 保存。
整体思路分三步：
- 先把 100 mM 稀释成2 mM 标准品储备液；
- 用 2 mM 储备液依次做出一系列更低浓度的标准品工作液；
- 上板时，每个标准孔加50 μL 标准 + 50 μL 工作液，和样本孔体系保持一致。
三、Step 1：100 mM → 2 mM 储备液
说明书推荐配法：
取20 μL100 mM 标准品 +980 μLLactate Assay Buffer，混匀。 得到2 mM 标准品储备液（1 mL）。
这 1 mL 2 mM 储备液，可以分装成若干小管（比如每管 100–200 μL），-20℃ 保存，最长 6 个月。
实际用的时候，只需要融化其中一小管，剩下的继续冻着。
四、Step 2：2 mM → 0.03–2 mM 梯度标准
说明书已经给了一个非常清晰的梯度表：
配液总原则是：每一步 1:1 稀释，浓度减半。
4.1 稀释表（关键内容）
下面这张表你可以原封不动搬到官网，也可以直接抄进实验记录本：
| 管号 | 标准品来源 | 标准品体积 (μL) | Buffer 体积 (μL) | 终体积 (μL) | 浓度 (mM) |
|---|---|---|---|---|---|
| S7 | 2 mM 储备液 | 200 | 0 | 200 | 2 |
| S6 | 2 mM 储备液 | 200 | 200 | 400 | 1 |
| S5 | 1 mM（S6 混匀后取） | 200 | 200 | 400 | 0.5 |
| S4 | 0.5 mM（S5） | 200 | 200 | 400 | 0.25 |
| S3 | 0.25 mM（S4） | 200 | 200 | 400 | 0.125 |
| S2 | 0.125 mM（S3） | 200 | 200 | 400 | 0.0625 |
| S1 | 0.0625 mM（S2） | 200 | 200 | 400 | 0.03125 |
| S0 | —（空白） | 0 | 200 | 200 | 0 |
表里的数字和说明书一致，只是帮你整理成更好读的形式：
4.2 实际操作顺序
- 标上 8 支离心管：S0–S7；
- 在 S7 管加入200 μL 2 mM 储备液，这是 2 mM；
- 在 S6–S1 每管先加好200 μL Buffer；
- 从 S7 管吸 200 μL 加到 S6，混匀，S6 就是 1 mM；
- 从 S6 管吸 200 μL 加到 S5，混匀，S5 就是 0.5 mM；
- 依次类推，直到 S1；
- S0 只加 Buffer，当作 0 mM 空白。
小建议：
- 每步稀释完都轻轻颠倒混匀，不要偷懒；
- 真要省时间，可以用涡旋器，但动作稍微温柔一点，避免起泡。
五、Step 3：标准上板时用多少？和样本要一致
在 96 孔板操作时，说明书给的体系是：
- 标准孔：50 μL 标准品工作液 + 50 μL Working Reagent
- 样本孔：50 μL 样本 + 50 μL Working Reagent
这样做的好处是：
- 反应体系体积一致；
- 所有孔 WST-8、LDH、Cofactor 的浓度一样，便于比较。
在排孔时，可以把 S0–S7 依次排在一列或两列，例如：
- A1–H1：S0–S7
- 或两列：A1–H1 放 S0–S3，A2–H2 放 S4–S7
相关细节可以和这篇配合看：延伸阅读：乳酸检测试剂盒操作步骤：96孔板SOP与孔位设计
六、Excel 计算模板：列怎么建、公式怎么写
下面给你一个最实用的模板结构，你可以在 Excel 里按这个做一个“母版”，每次复制一份用。
当然，最省时省力的方法是使用该试剂盒配套的计算机：
乳酸含量计算器 - KTB1100 - 亚科因生物(Abbkine) https://calculate.abbkine.cn/KTB1100/
6.1 标准曲线工作表（Sheet：StdCurve）
列设置示例：
| 列名 | 说明 |
|---|---|
| A：Tube | S0–S7 |
| B：Conc_mM | 对应浓度（0, 0.03125, …, 2） |
| C：A_raw | 450 nm 读数（标准孔原始 A） |
| D：A_blank | 空白孔 A 值（S0，整列引用即可） |
| E：DeltaA | =C2 - $C$2 或 =C2 - A_blank（看你怎么写） |
| F：用于拟合 | 和 E 一样，用来画图 |
关键：要先扣空白说明书的做法是：ΔA标准 = A标准 − A空白。
在 Excel 里可以直接写成：
- 假设 S0 的 A 值在 C2，S1 在 C3：
- E2（S0）： =0
- E3（S1）： =C3 - $C$2
- 往下填充到 E9（S7）
然后用**“ΔA（横轴）– 浓度（纵轴）”** 做一个散点图，加线性拟合，勾选显示方程和 R² 值。说明书示例中的拟合方程类似：
y = 2.2613x - 0.0531，R² 接近 1。
6.2 样本计算工作表（Sheet：Samples）
列设置示例：
| 列名 | 说明 |
|---|---|
| A：Sample_ID | 样本编号 |
| B：A_raw | 样本孔 450 nm 读数 |
| C：A_blank | 空白孔 A（同一板统一引用 S0 的 A 值） |
| D：DeltaA | =B2 - |
| E：Conc_mM | 利用标准曲线方程计算的浓度 y |
| F：Dilution | 样本稀释倍数（原样本有稀释填在这里，例如 5、10） |
| G：Final_mM | =E2 * F2（把稀释倍数算回去） |
| H：归一化结果 | 按质量/细胞数/蛋白量等再算一列（看你习惯） |
说明书中给出了不同归一化方式的公式，比如按体积、质量、细胞数或蛋白量计算乳酸含量，你可以直接把那几条公式抄到工作表底部当“备忘”。
七、常见问题：曲线不好看怎么办？
1）某几个点“拐弯”了
- 先看是不是配错管：尤其是中间几级稀释，S4/S5 很容易挪错。
- 确认每一管都有混匀，特别是从上一管移 200 μL 过来之前。
2）最高点 ΔA 特别高，远超其他点
- 说明书建议：如果样本 ΔA 测定 > 1.0，说明浓度太高，需要稀释再测。
- 对标准曲线来说，如果最高点已经明显接近仪器上限，可以把 2 mM 那个点去掉，只用 1 mM 往下做线性拟合。
3）最低点 ΔA 接近 0，分不清
- 说明书给了一个经验数：样本 ΔA < 0.13 时，可以考虑增加样本量。
- 对标曲来说，只要 S1–S7 的 ΔA 逐级上升、R² 接近 1，最低点接近 0 是正常的。
4）整条线性不好，R² 很难上去
- 检查：
- 标曲配制顺序是否严格按 1:1 来；
- 孵育时间有无统一（某些孔晚加工作液）；
- 是否有气泡、污点影响读数。
- 必要时，重做一条标曲；一块板最多 10 分钟就能重配一条，别省这点时间。
八、小结
只要你按着：
- 100 mM → 2 mM 储备液；
- 2 mM → 0.03–2 mM 梯度稀释；
- Excel 模板里固定好列和公式或直接使用该产品配套的计算器工具：https://calculate.abbkine.cn/KTB1100/
以后每次做乳酸实验，标准曲线就是一个“机械动作”，不再是需要反复推算的难题。
