乳酸检测A值异常怎么办：ΔA过高/过低/背景大一次性排查清单
本文是《乳酸含量检测应用指南（科研）》系列之一， 完整流程请见：乳酸含量检测应用指南（科研）
乳酸板子跑完，最常见的几种心情：
- “ΔA 都快顶到天花板了，是不是线性爆掉了？”
- “ΔA 小得可怜，和空白差不多；这还怎么算？”
- “空白和背景高得离谱，整条曲线都被压扁了。”
其实绝大多数情况，都可以归到下面这几类现象。 我们先给你一张**“现象-原因-动作”总表**，再往下逐条拆解。
01 一张表看懂常见 A 值异常
| 现象 | 常见原因 | 处理建议 |
|---|---|---|
| ΔA 过高/接近饱和 | 样本浓度太高，超出 0.03–2 mM 线性范围；上样量过大 | 按说明书建议：ΔA 测定 > 1.0 时，用 Assay Buffer 适当稀释样本，计算时乘稀释倍数 |
| ΔA 过低 | 样本含量本身偏低；稀释倍数过大；上样量不足；标准曲线不稳定 | ΔA 测定 < 0.13 时，可增加样本量或降低稀释倍数；检查标准曲线和孵育条件 |
| 空白/背景偏大（A 空白很高） | Working Reagent 放置过久或未避光；样本本身有 NADH/NADPH 或强底色干扰 | 现配现用工作液，37℃ 避光孵育；按说明书建议做“无 LDH 背景孔”或 10 kDa 超滤 |
| ΔA 为负数或接近零 | A 测定 ≤ A 空白；样本本身几乎无乳酸；孔位被污染；读板顺序/时间差过大 | 优先排除孔污染和读板错误；确认样本是否应有乳酸；必要时重新做一板或换一批样本 |
| 重复性差（同一样本差异大） | 配液不一致；逐孔加工作液时间差太大；边缘孔效应；样本前处理不稳定 | Working Reagent 一次配齐并留余量；统一加样/计时；优先用中间孔，必要时避免边缘孔 |
| 整板 A 值整体偏高或偏低 | 孵育温度/时间严重偏离；酶标仪问题；标准品配制错误 | 检查 37℃ 孵育 30 min、450 nm 波长设定；重新配标准品和工作液，再做一条标曲 |
02 ΔA 过高/接近饱和：先别慌，先“稀释”
说明书在 FAQ 里写得很明确：
1.0，则说明样本乳酸含量太高，需用 Lactate Assay Buffer 适当稀释（计算公式中乘以相应稀释倍数）。”
实操怎么做？
- 先选 2–3 个代表性样本，看 ΔA 落在哪个量级：
- 如果大多在 0.8–1.2 左右，建议直接提高稀释倍数，比如从 5× 换成 10×；
- 如果已经明显顶到 450 nm 上限，建议这批数据作废，重新按更高稀释倍数跑一板。
- 稀释后重新上板：
- 计算时在公式里把稀释倍数 n 填对即可，说明书的液体样本公式就是“浓度 = y × n”。
- 标曲也要一并看：
- 确认最高点（2 mM）本身没有饱和；
- 若最高点 ΔA 已经非常高，可以考虑只用 1 mM 以下的点做拟合。
一句话：ΔA 太高最常见的原因就是“样本太浓”，优先用稀释解决，不要强行接受一条已经“拐头”的线性。
03 ΔA 太低：是样本太少，还是方法没喂饱？
说明书里同一条 FAQ 也写了另一半：
“如果样本的 ΔA 测定 < 0.13，可提高样本量。”
结合你实际实验，可以从三块排查：
- 确认样本是不是本来就很低
- 比如对照组、小剂量处理组或者某些特殊组织，本身乳酸水平就接近检测下限；
- 如果是这种情况，可以接受 ΔA 稍低，只要重复性好、标准曲线正常。
- 看是否稀释过头
- 比如盲目照搬别的实验“统一 10× 稀释”，结果自己这批样本本来就低；
- 可以在预实验里比较“原液、2×、5×”三档，选一档让大部分样本落在 ΔA 0.2–0.8 区间。
- 检查孵育和配液
- 工作液是否现配现用；
- 孵育是否真的 37℃、30 min 左右，没少孵也没严重超时；
- 有没有某一板混进“冷板”/“温度没上来”的情况。
总之：ΔA 低的时候，不要一上来就怀疑试剂盒。先确认样本、稀释倍数、孵育条件，再考虑增加上样量。
04 空白/背景偏大：要想到 NADH/NADPH & 内源性 LDH
说明书专门提醒了两类会带来背景的东西：
- NADH / NADPH：
- 细胞、组织提取物里这类分子多，会直接参与显色，让不加乳酸的孔也变黄。
- 内源性 LDH：
- 细胞培养液、细胞/组织裂解液中自带 LDH，会继续降解乳酸，打乱体系。
说明书给了两个解决思路：
- 做背景孔（无 LDH 孔）
- 用同样数量的样本，在“没有乳酸脱氢酶”的条件下做一份反应；
- 最后用“乳酸孔读数 − 背景孔读数”，把 NADH/NADPH 背景扣掉。
- 10 kDa 超滤去蛋白
- 用 10 kDa 超滤管，12000 g，4℃ 离心 10 min，去除蛋白质，取滤液做检测。
- 对含 LDH 的样本（细胞培养液、细胞/组织裂解液等），按说明书建议：
除此之外，还要注意：
- Working Reagent 必须现配现用、避光；
- 孵育时注意 37℃ 避光，避免 WST-8 自发还原导致空白慢慢变黄。
一个简单经验：
- 细胞 / 组织 / 植物样本：建议至少加一列背景孔；
- 血清 / 血浆 / 尿液：先看预实验，如果空白还行，可以不强制做背景孔。
05 ΔA 为负数或接近零：先看板，再看样本
ΔA = A测定 − A空白，如果算出来是负数，大致只有几种可能：
- 空白孔被污染（比样本还“黄”）
例如加样时滴了一点样本进空白孔；
或者拿空白孔当“临时混匀孔”，又没及时换。
→ 这种情况通常只会影响个别孔，直接标记为无效孔，必要时补做。
- 读板顺序和时间差太大
比如孵育结束后没有统一读板，有的孔 20 min 后读，有的孔 40 min 后才读；
→ 建议固定一个孵育时间，孵育一到时间就整板一起读。
- 样本乳酸本身确实非常低
有时对照组/健康组乳酸接近背景，ΔA 略微波动是正常的；
→ 这种情况可以通过增加样本量、降低稀释倍数来改善，也可以直接标注为“接近检测下限”。
如果整板很多孔都出现“ΔA 接近 0 或略为负数”，那就要考虑标准曲线、工作液、孵育条件是否出了系统性问题，建议重配再跑一板。
06 重复性差：大多是“人”和“板”的问题
说明书已经把板上条件尽量简化了：每孔样本 50 μL + 工作液 50 μL，37℃ 避光孵育 30 min，在 450 nm 读数。
如果同一样本的重复孔差很多，常见原因是：
- 工作液分批配、边加边配
- 理论上应该一次配齐所需孔数的工作液，说明书也要求“Working Reagent 需现配现用”。
- 若分批次配，成分比例稍有差异，就会引入变异。
- 加样时间拉得太长
- 从第一孔加样到最后一孔加完，可能中间差了十几分钟；
- 对酶反应体系来说，这是实打实的“起跑时间差”。
- 边缘孔效应
- 板边缘的孔受温度、蒸发等影响更明显；
- 尤其是孵育时间长、板边暴露在空气中的情况下。
应对动作：
- Working Reagent 按整板孔数一次配齐，并预留 5–10% 余量。
- 加样顺序固定：先全部加样本/标准，再统一用多道排枪加工作液，随后立即开始计时孵育。
- 样本重复孔尽量排在板的中间区域（比如 B–G 行），空出最外圈给空白/对照或不用。
07 整板整体偏高 / 偏低：优先怀疑“系统性”问题
如果你发现：
- 所有标准点 ΔA 都明显低于以往；
- 或者整条标准曲线非常陡峭/非常平缓、R² 一直上不去，
可以按这条线查：
- 孵育条件
- 确认恒温箱/酶标仪孵育模块是否真的到了 37℃；
- 实际孵育时间是否接近 30 min，而不是“忘在里头 1 小时”或“提早拿出来”。
- 工作液配制
- Lactate Assay Buffer、Cofactor、WST-8、Enhancer、LDH 的体积比例是否按说明书给的 31/8/5/1/10 配；
- 是否有人不小心把组分加错管、漏加某个组分。
- 标准品配制
- 100 mM → 2 mM 储备液时是否吸错体积（20 μL + 980 μL）；
- 梯度稀释是否严格按 1:1 稀释，浓度是否对应正确。
- 仪器问题
- 450 nm 滤光片是否设置正确；
- 若有条件，可以用一块“以前做过、结果可靠的板”复测一两个孔，看看读数是否明显偏移。
如果实在排查不出明确原因，最稳妥的做法是：重配所有试剂（特别是工作液和标准品），再做一板。一套乳酸试剂盒本身多给了 10% 余量，就是方便你做预实验和重测。
