WST-8乳酸比色法原理详解：LDH体系与450 nm读数

本文是《乳酸含量检测应用指南（科研）》系列之一， 完整流程与配套文章请见：乳酸含量检测应用指南（科研）

很多人做乳酸实验，操作步骤背得滚瓜烂熟，但一问“为什么要在 450 nm 读数”“WST-8 到底在体系里干了什么”，脑子就开始打转。

这篇文章就做一件事：把 WST-8 微量比色法的原理，用“实验人员能听懂”的语言讲清楚，顺带把和原理相关的几个“隐形坑”标出来。

一、反应全貌：从乳酸到 450 nm 的信号链

用一句话概括：

乳酸 → LDH 催化 → 产生 NADH → 把电子交给 WST-8 → 生成黄色产物 → 450 nm 读数

拆开看就是四步：

1. 底物反应：L-乳酸在乳酸脱氢酶（LDH）作用下，被氧化成丙酮酸，NAD⁺ 同时被还原成 NADH。
2. 电子“中转站”：体系里通常有一个电子载体（递氢剂），帮助 NADH 把电子转给 WST-8。
3. WST-8 显色：WST-8 接到电子后，被还原生成一种黄色可溶性的 formazan 类产物。
4. 光学检测：这一黄色产物在450 nm 左右有最大吸收峰，在酶标仪上读 A450，吸光度大小与产生的 formazan 量相关，也就和样本乳酸含量成正比（在一定范围内）。

所以你板子上的每一个“黄色孔”，背后都是这一条信号链在运转。

二、LDH 反应：真正“盯住乳酸”的那一步

体系里真正“识别乳酸”的，是乳酸脱氢酶 LDH，不是 WST-8。

• LDH 只会催化乳酸 → 丙酮酸这个反应（在合适的 pH 和缓冲体系下），
• 乳酸越多，被转化出的 NADH 就越多，
• 后面的 WST-8 显色，本质是在“数”这一步产生了多少 NADH。

这就是为什么：

• 含有大量内源性 LDH 的样本（某些组织、培养液）如果不处理好，可能会让体系失控，要么自己继续“乱催化”，要么改变底物平衡。
• 说明书里经常会提醒：含 LDH 的样本建议做去蛋白/超滤处理，就是为了把这一步“交给体系里的试剂盒 LDH”，而不是任由样本里的酶瞎搅和。

三、WST-8 与传统比色底物的区别

很多人会拿 WST-8 和以前常用的 MTT、INT 之类对比。

WST-8 的特点大致有几个：

1. 产物水溶性好

   生成的是水溶性色素，不像 MTT 那样要再加有机溶剂溶解晶体，操作上简单很多，也减少了打破平衡的步骤。

2. 灵敏度和线性范围更友好

   WST-8 的摩尔吸光系数较大，信号响应更显著，线性区范围也相对可观，比较适合做微量测定和 96 孔板。

3. 读数波长在 450 nm 左右

   这个波长对常见酶标仪来说非常友好，大部分设备的 450 nm 滤光片性能都比较稳定，光源也好配。

4. 体系总体更温和

   整个反应可以在比较温和的条件下进行（比如 37℃、缓冲液介质），对样本和实验人员都比较友好。

简单说：WST-8 是为了让比色法更容易“微量化、高通量化”而设计的一类底物，非常适合现在这种 96 孔板、几十上百样本一起跑的乳酸检测场景。

四、为什么一定要在 450 nm 读数？

不是随便挑了一个波长，而是因为：

• WST-8 还原生成的黄色产物，在 450 nm 左右有明显吸收峰；
• 在这个波长，
• 信号强（吸光度变化大），
• 背景相对低，
• 大部分常见缓冲液/体系干扰较小。

如果偏离 450 nm：

• 往短波走，可能会碰到缓冲液或杂质的吸收峰，背景抬高；
• 往长波走，信号强度下降，灵敏度变差。

所以你在说明书上看到的都是“450 nm 读数”，不是凑巧，而是基于 WST-8 光谱特性的最优折中点。

五、和原理直接相关的几个实验“隐形注意事项”

原理听懂了，下面这些常见问题会更好理解，也更好规避。

1）为什么要避光孵育？

• WST-8 和递氢体系在强光下容易缓慢自反应，造成空白孔慢慢变黄，背景升高。
• 避光孵育就是为了把“与乳酸无关的自发还原”压到尽量低，让信号主要来自 LDH 反应这一路。

所以说明书里写“37℃避光孵育 XX 分钟”，不是形式主义，真的是在保护你的信噪比。

2）为什么一定要扣空白、甚至做背景孔？

• 空白孔（Buffer + 工作液）扣掉的是体系本身的背景：底物轻微自还原、缓冲液轻微吸光等。
• 背景孔（样本 + 工作液但不给 LDH 或不给乳酸底物）扣掉的是样本自身的吸光/还原性物质。

原理上看很容易理解：

你真正要的是“因为乳酸被 LDH 转化而导致的那部分信号”，其余都应该尽量被扣掉。

3）为什么有些样本需要去蛋白/超滤？

原因有两类：

• 样本里带了自己的酶（包括 LDH 或其他脱氢酶），会额外消耗/产生 NADH，扰乱体系；
• 样本里有较多还原性物质或色素，直接参与/干扰 WST-8 的还原。

去蛋白/超滤，就是想把“谁来还原 WST-8”这件事，尽量只交给试剂盒设计好的那条反应链。

4）为什么 Working Reagent 要现配现用？

Working Reagent 里通常混合了：

• LDH（酶）
• Cofactor（比如 NAD⁺）
• WST-8 底物
• 递氢体系等

这些东西一旦混在一起，就已经具备了“慢慢反应”的潜力。

现配现用，是为了保证：

• 你上板的时候，体系状态尽量一致；
• 空白孔背景不会因为放久了而一点点往上爬；
• 不同批次样本之间，反应起点尽量一致。

六、小结：知道原理后，你可以做到什么？

理解了“乳酸 → LDH → NADH → WST-8 → A450”这条链，你在实验设计上就会更有把握：

• 知道哪些干扰来自样本本身，哪些来自体系
• 知道为什么要避光、为什么要扣空白/背景、为什么要现配工作液
• 知道在什么情况下要考虑去蛋白、超滤或改变样本处理方式

这样一来，同样是一套乳酸检测试剂盒，你能跑出来的结果会更稳定、可解释空间也更大。