组氨酸标签蛋白纯化试剂盒(Ni-NTA树脂)-PurKine™

样本制备

细菌或酵母表达蛋白

1. 7,000 rpm 15 min诱导表达蛋白后，将细菌或酵母培养液转移至离心管中，离心，收集细菌或酵母细胞。
2. 按照菌体：Lysis buffer=1:10 (W/V)的比例加入Lysis buffer，加入终浓度1 mM PMSF 0.2-0.4 mg/mL。建议加入终浓度10 μg/mL溶菌酶、5 μg/mL RNaseA和5 μg/mL DNase I。
3. 重悬细胞。如果细胞浓度较高，则可加入10 μg/mL RNaseA和5 μg/mL DNase I。将悬浮液在冰中混合并超声破碎，至菌液基本澄清。
4. 将澄清的破碎液转移至新的离心管中，10,000 rpm 4℃离心20-30 min，取上清，置于冰上待用或-20℃保存。

酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

1. 将细胞培养液转移至离心管，5,000 rpm 10 min离心，收集上清。如果上清中含有EDTA、组氨酸和其他还原剂等物质，需用Lysis buffer透析。
2. 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，蛋白还需用Lysis buffer透析。

包涵体纯化（变性条件）

1. 7,000 rpm 15 min将培养液转移至离心管中，离心收集菌体，弃上清。
2. 按照菌体：Lysis buffer=1:10 (W/V)的比例加入Lysis buffer（8 M尿素中不含），重悬菌体，冰浴超声破碎。
3. 10,000 rpm 4℃离心20-30 min，弃上清，重复步骤2和3。
4. 按照菌体：Lysis buffer=1:10 (W/V)的比例加入Lysis buffer（8 M尿素中含），重悬菌体。

试剂准备

建议在使用之前通过0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤所有缓冲液。对于大多数蛋白质，建议使用以下缓冲液：

注意：有时过表达蛋白在包涵体中。His标签蛋白的包涵体可溶于8 M尿素或6 M盐酸胍。可以使用以下推荐缓冲液：

对于咪唑洗脱法，准备以下缓冲液：

• Lysis buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0
• Wash buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0
• Elution buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0

对于pH洗脱法，准备以下缓冲液：

• Lysis buffer: 8 M Urea, 100 mM NaH₂PO₄, 100 mM Tris·HCl, pH 8.0
• Wash buffer: 8 M Urea, 100 mM NaH₂PO₄, 100 mM Tris·HCl, pH 6.3
• Elution buffer: 8 M Urea, 100 mM NaH₂PO₄, 100 mM Tris·HCl, pH 4.5

蛋白纯化流程

1. 固定重力柱，去掉上端塞和下端塞，流干保护液。
2. 向柱中加入5倍柱体积的Lysis Buffer (Ni-NTA)，平衡柱子使树脂与目标蛋白在相同的缓冲系统中，以保护蛋白，流干Buffer。
3. 将蛋白提取物样本加入树脂中孵育。为了提高目标蛋白的回收率，控制流速，确保目标蛋白与Ni²⁺充分接触。
   注意：收集流穿液，可通过SDS-PAGE分析。出现问题时，更容易找到解决办法。
4. 向柱中加入10-15倍柱体积的Wash Buffer，去除非特异性吸附蛋白。注意收集洗杂液。
5. 向柱中加入5-10倍柱体积的Elution Buffer，收集的洗脱液即是目标蛋白溶液。
6. 依次向柱中加入3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水，平衡Ni-NTA树脂。为防止树脂被细菌污染，将树脂储存在等体积的含20%乙醇的PBS中，温度为4-30℃。
7. 通过SDS-PAGE分析各组分样本，检测纯化效果。

在位清洗（CIP）

树脂使用过程中发现反压过高和树脂上出现明显污染时，需要进行在位清洗操作（Cleaning-in-Place, CIP）。建议按照下面操作去除树脂上残留的污染物，如沉淀蛋白，疏水蛋白和脂蛋白。

去除强疏水结合蛋白，脂蛋白和脂类：

通过使用30%异丙醇清洗5-10倍柱体积，接触时间15-20 min可去除此类污染物。然后，再使用10倍树脂体积的去离子水清洗。

也可使用含有去垢剂的酸性或碱性溶液，清洗2倍柱体积，如含0.1-0.5%非离子表面活性剂的0.1 M乙酸溶液，接触时间为1-2 h。最后使用10倍柱体积的去离子水清洗。

去除离子作用结合的蛋白：

使用1.5 M NaCl溶液清洗10-15 min。然后再使用去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生

一般情况下，Ni-NTA树脂至少可以使用5次，然后才需要对其进行再生。当反压过高或载量明显偏低时，需要剥离金属离子，按照以下步骤对树脂进行再生：

1. 使用5倍柱体积去离子水清洗树脂。
2. 使用5倍柱体积100 mM EDTA (pH 8.0)剥落镍离子。
3. 使用10倍柱体积去离子水清洗树脂。
4. 使用0.5 M NaOH清洗5倍柱体积，停留10-15 min。
5. 使用10倍柱体积去离子水清洗树脂。
6. 使用3-5倍柱体积100 mM NiSO₄再生挂镍。
7. 使用10倍柱体积去离子水清洗树脂。

树脂再生后可立即使用，或将树脂重悬于等体积含20%乙醇的PBS中，置于4℃保存。

化学相容性

常用缓冲液

50 mM磷酸盐, pH 7.4, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM Tris-acetate, pH 7.4, 100 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM MOPS, pH 7.4, 100 mM乙酸钠, pH 4.0