线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

• ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Solution：临用前配制，对于 48 T，ReagentⅣ加入 11.4 mL ReagentⅢ和 0.3 mL去离子水，对于 96 T，ReagentⅣ加入 22.8 mL ReagentⅢ和 0.6 mL去离子水，充分混匀待用；未用完的试剂-20℃避光保存一周，避免反复冻融。

样本制备

1. 血清（浆）样本：直接检测。
2. 组织、细胞和细菌中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取
   1. 称取约 0.1 g组织或收集 500万个细胞和细菌，加入 1 mL Extraction Buffer和 10 μL ReagentⅡ，冰浴匀浆，600 g，4℃离心 5 min，收集上清至新的离心管中，舍弃沉淀。
   2. 再次离心上清，11,000 g，4℃离心 10 min，分别得到上清和沉淀。
   3. (选做)第(2)步的上清液即胞浆提取物，可用于直接测定从线粒体泄漏的mMDH。
   4. 在第(2)步的沉淀中，加入 200 μL ReagentⅠ和 2 μL ReagentⅡ混匀，用于线粒体mMDH测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Solution于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 10 min。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中加入 5 μL样本和 195 μLWorking Solution，迅速混匀后于 340 nm检测，记录 20 s和 1 min 20 s的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA=A1-A2。

结果计算

A. 使用 96孔板测定的计算公式

1. 按血清（浆）计算

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

2. 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

3. 按细胞或细菌密度计算：

单位的定义：每 1万个细胞或细菌在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ mol/L/cm；d：0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；T：反应时间，1 min；ΔA 上清：上清测定值；V 提取：加入提取液体积，1.01 mL；W：样品质量，g；ΔA 沉淀：沉淀测定值；V 样总：加入 ReagentⅠ和Ⅱ的体积，0.202 mL；500：细胞或细菌总数，500万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。