555偶联试剂盒(尤其适合分子量6-20 KD样本)-LinKine™-AbFluor™

自备耗材

• 待标记样本
• 移液器和吸头
• 去离子水
• PBS (pH 7.4)

样本制备

待标记样本的初始浓度应高于2 mg/mL，建议蛋白浓度达到2.5 mg/mL以上效果最佳，否则实验前需进行浓缩以提高浓度。待标记样本的组分（或储存缓冲液）应符合如下要求：

• (1) 不含有氨基成分，否则会影响偶联效果。
• (2) 少量BSA不会影响偶联效果，但建议使用PBS作为缓冲液。
• (3) 若样本中含有可能干扰标记的物质，建议用PBS置换缓冲液，具体方法为：将样本加入超滤管中，加入200-150 µL PBS，12,000 g、4℃、离心10 min，弃掉滤液；再次补齐PBS，12,000 g、4℃、离心10 min；离心后取出超滤管内芯，倒置于干净外管中，4,000 g、4℃、离心2 min，收集置换缓冲液后的样本。

待标记样本的缓冲液应满足如下要求：

实验步骤

1. 偶联物制备

不同规格建议的最适标记样本量和标记体系如下：

注意：请根据实际样品量，相应放大或缩小试剂盒各组分在反应体系中的体积。

以下操作步骤是以3×100 µg规格为例，其它规格的试剂用量请进行等比调整。如果需要调整体积，请保持样本量不变更改标记体系中FITC labeling solution、Activated FITC solution和去离子水的体积。

1. 向待标记样本溶液中加入15 µL FITC labeling solution，用移液器温和混匀。
2. 吸取7.5 µL Activated FITC solution至步骤(1)反应液中，加去离子水至150 µL（注：此体积为标记体系），温和混匀，37℃避光静置1 h。

注：步骤(1)/(2)属于标记步骤。

3. 向步骤(2)反应液中加入适量PBS（定容至约500 µL），温和混匀，将溶液移至纯化柱，12,000 g、4℃、离心10 min。
4. 弃滤液，加适量PBS（定容至约500 µL）到纯化柱，4℃、12,000 g、离心10 min。
5. 取出纯化柱倒置于干净离心管中，4℃、4,000 g、离心2 min，离心管收集到的溶液即为偶联产物。

注：步骤(3)/(4)/(5)属于纯化步骤。

2. 偶联物储存

偶联产物避光条件下可稳定保存一个月。若需长期储存，请加入等体积甘油分装并于-20℃下避光保存，避免反复冻融。

结果计算

1. 偶联物浓度的计算：

C (mg/mL) = {[A₂₈₀-(A_max×CF)]/1.4}×稀释因子

其中：C是指实验收集的偶联物浓度；稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数（详见备注）；A₂₈₀和A_max分别是指在280 nm处的吸光度以及在最大吸收波长（FITC的最大吸收波长为492 nm）处的吸光度；CF是校正因子，FITC的CF值为0.254；1.4是指FITC（IgG）的消光系数，为7300 mL/mg。

2. 偶联物标记程度（degree of labeling, DOL）的计算：

DOL = (A_max×Mwt)/(ε×C×稀释因子)

其中：A_max指在最大吸收波长处的吸光度（FITC的最大吸收波长为492 nm）；稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数；C是指实验收集的偶联物浓度；Mwt是指待标记样本的分子量；ε是荧光染料的消光系数，FITC的消光系数为7300。

备注：过柱洗脱的偶联物直接用于吸光度检测可能浓度过大，因此需要稀释到适当浓度（蛋白测定仪的浓度范围）。稀释倍数（即稀释因子）需要从起始样本质量以及洗脱得到的偶联物的总体积来进行预估，如未经稀释则稀释因子为1。

常见问题

问1：浓缩后样本浓度仍低于1-2 mg/mL?

答1：如果浓缩后样本浓度仍小于1-2 mg/mL可适当调整标记体系的体积，但最终浓度应大于1 mg/mL。步骤(1)中FITC labeling solution的体积应为标记体系体积的10%，步骤(2)中Activated FITC solution的体积保持不变，可不添加去离子水，您也可以根据自己的实验进行适当调整。

问2：待标记样本分子量大小不同，如何选择合适的纯化柱？

答2：本产品配备的超滤管适用于分子量为6-20 KD的样本。若您需要偶联的样本分子量大于20 KD，为保证偶联最佳效果，需另行配备大小合适的超滤管。

问3：待标记样本分子量与FITC相近？

答3：如果样本分子量与FITC相近，可在进行完此说明书对应的标记步骤后加入30 µL 0.5 µM NH₄Cl，37℃下孵育10 min，以淬灭游离的FITC，无须进行此说明书对应的纯化步骤。

注意事项

1. 不同批次号、不同的厂家的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
2. 混合或复溶组分时，避免产生气泡。如有未使用完的试剂，请及时密封保存于-20℃。
3. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
4. 保持好的实验习惯，穿戴好手套、实验服、口罩、防目镜等防护工具后再开始实验。