柠檬酸合酶(CS)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 412 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、水浴锅、制冰机、恒温箱
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。
  注意：ReagentⅡ有毒，建议在通风橱进行实验。
• ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Reagent：临用前配制，48 T使用 13.2 mL ReagentⅢ溶解 ReagentⅣ和 ReagentⅤ；96 T使用 26.4 mL ReagentⅢ溶解 ReagentⅣ和 ReagentⅤ；未用完的工作液请分装-20℃避光保存 1个月，避免反复冻融。
• Working ReagentⅥ：临用前配制，48 T加入 0.6 mL去离子水，充分溶解备用；96 T加入 1.2 mL去离子水，充分溶解备用；未用完的试剂请-20℃避光保存 1个月，避免反复冻融。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月，处理好的样本须当天检测。上清和沉淀中可能都存在酶活，建议两部分都检测，加和结果更准确。

组织、细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取：

1. 称取约 0.1 g组织或收集 500万个细胞，加入 1 mL Extraction Buffer和 10 μL ReagentⅡ，冰浴匀浆，600 g，4℃离心 5 min，收集上清至新的离心管中，舍弃沉淀。
2. 再次离心上清，11,000 g，4℃离心 10 min，分别得到上清和沉淀。
3. （选做）第 2步的上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS。
4. 在第 2步的沉淀中，加入 200 μL ReagentⅠ和 2 μL ReagentⅡ混匀，用于线粒体 CS测定。

注意：该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1270、KTB1290、KTB1280、KTB1240、KTB1230、KTB1250的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 412 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. Working Reagent 在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴提前预热 5 min。
3. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入 10 µL样本、220 µL Working Reagent和 10 µL Working ReagentⅥ，迅速混匀后于412 nm检测，记录 20 s和 2 min 20 s的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.3，样本可用对应的 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔板测定的计算公式

1. 组织中 CS活力的计算（按样本质量）：

单位的定义：在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中，每 g组织在反应体系中每分钟催化 1 nmol TNB 氧化定义为一个酶活力单位。

2. 细胞中 CS活力的计算（按细胞数量）：

单位的定义：在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中，每 1万个细胞在反应体系中每分钟催化 1 nmol TNB 氧化定义为一个酶活力单位。

ΔA 上清：上清测定值；ΔA 沉淀：沉淀测定值；V 反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/mol /cm；d：0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 提取：加入提取液体积，1.01 mL；V 样总：加入 ReagentⅠ和Ⅱ的体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；W：样品质量，g；N：细胞总数，以万计。

B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。