线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 制冰机，低温离心机
• 水浴锅
• 96孔 UV板或微量石英比色皿
• 可调节式移液枪及枪头

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。

注意：ReagentⅡ有毒，建议在通风橱进行实验。

• ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Solution：临用前配制，使用 ReagentⅢ溶解 Reagent IV，配制好的Working Solution 4℃保存 1个月。
• Working ReagentⅤ：临用前配制，对于 48 T试剂盒，请加入 0.6 mL去离子水充分溶解粉剂；对于 96 T试剂盒，请加入 1.2 mL去离子水充分溶解粉剂；未用完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。上清和沉淀中可能都存在酶活，建议两部分都检测，加和结果更准确。

组织、细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取：

1. 称取约 0.1 g组织或收集 500万个细胞，加入 1 mL Extraction Buffer和 10 μL ReagentⅡ，冰浴匀浆，600 g，4℃离心 5 min，收集上清至新的离心管中，舍弃沉淀。
2. 再次离心上清，11,000 g，4℃离心 10 min，分别得到上清和沉淀。
3. （选做）第 2步的上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 ICDHm。
4. 在第 2步的沉淀中，加入 200 μL Reagent I和 2 μL ReagentⅡ混匀，用于线粒体 ICDHm测定。

注意：该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1270、KTB1290、KTB1280、KTB1240、KTB1230、KTB1023的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Solution于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 10 min。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中依次加入 10 µL样本、180 µL Working Solution和 10 µL Working ReagentⅤ，迅速混匀后于 340 nm检测，记录 20 s和 2 min 20 s的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.3，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

2. 按细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ mol/L/cm；d：0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，2 min；ΔA 上清：上清测定值；V 提取：加入提取液体积，1.01 mL；W：样品质量，g；ΔA 沉淀：沉淀测定值；V 样总：加入ReagentⅠ和Ⅱ的体积，0.202 mL；N：细胞总数，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

1. 因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测多个样本。