α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、水浴锅、制冰机、恒温箱
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；-20℃避光保存。
• ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• 工作液：临用前配制，将 ReagentⅢ粉剂、ReagentⅣ、ReagentⅤ粉剂和 ReagentⅥ粉剂依次转移到 ReagentⅡ中，混匀溶解后待用；现用现配。

注意：ReagentⅣ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

Working ReagentⅦ：临用前配制，对于 48 T试剂盒，加入 0.6 mL去离子水充分溶解粉剂；对于 96 T试剂盒，加入 1.2 mL去离子水，充分溶解粉剂；未用完的试剂需-20℃避光保存 1个月，避免反复冻融。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

1. 动植物组织

称取约 0.1 g组织，加入 1 mL ExtractionBuffer和 10 μL ReagentⅠ，冰浴匀浆，11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 细胞

收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL ExtractionBuffer和 10 μL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 10 min。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中依次加入 10 µL样本、10 µL Working ReagentⅦ和 180 µL工作液，迅速混匀后于 340 nm检测，记录 20 s和 2 min 20 s的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA 测=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.3，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算

单位的定义：在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中，每 g组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V 样总×V 样)÷T×F=3,247.59×ΔA÷W×F

2. 按细胞密度计算

单位的定义：在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中，每 1万个细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH 活性(U/10⁴ cells)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(N÷V 样总×V 样)÷T×F=3,247.59×ΔA÷N×F

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1.01 mL；T：反应时间，2 min；W：样品质量，g；N：细胞总数，万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测过多样本。