Ca2+/Mg2+-ATP酶活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 660 nm 处的吸光度）
• 水浴锅
• 96 孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working ReagentⅠ：临用前添加 7.2 mL 去离子水溶解；-20℃避光保存 1 周。

ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working ReagentⅢ：临用前添加 3 mL 去离子水溶解；4℃避光保存 2 周。

Working ReagentⅣ：临用前添加 25 mL 去离子水溶解；4℃避光保存 2 周。

Working ReagentⅤ：临用前添加 25 mL 去离子水溶解；4℃避光保存 2 周。

ReagentⅥ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

0.5 μmol/mL 标准磷应用液配制：将 Standard 20 倍稀释，即取 0.1 mL Standard 加 1.9 mL 去离子水充分混匀。

定磷剂的配制：按去离子水: Working ReagentⅣ: Working ReagentⅤ: ReagentⅥ=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现配现用。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿避免磷污染。

注意：ReagentⅢ有刺激性气味，ReagentⅤ有毒，ReagentⅥ有腐蚀性，建议在通风橱进行实验。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1 个月。

1. 血清（浆）等液体样本

可直接检测。

2. 动植物组织样本

按 0.1 g 组织加入 1 mL 的 Extraction Buffer 的比例进行冰浴匀浆。匀浆液于 4℃，8,000 g 离心 10 min。取上清，置于冰上待测。

3. 细菌和细胞样本

收集 500 万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS 清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）进行样本蛋白质浓度测定。

注意：2. 该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1800 的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 660 nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2. 酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）

混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴锅准确反应 10 min

混匀，4,000 g，常温离心 10 min，取上清液

3. 定磷（96 孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂）

混匀，室温放置 30 min，在 660 nm 处，记录各管吸光值 A，分别记为 A 空白、A 标准、A 对照、A 测定。

注意：每个样本均需要做对照孔，空白孔和标准孔各做 1 个孔即可。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果 A 测定-A 对照小于 0.001 可适当加大样本量。如果 A 测定-A 对照大于 1.5，样本可用 Extraction Buffer 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 血清（浆）等液体样本 Ca2+/Mg2+-ATPase 活力的计算

定义：规定每小时每毫升血清（浆）中 Ca2⁺/Mg2⁺-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca2+/Mg2+-ATPase 活力(U/mL)=7.5×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)

2. 组织、细菌或细胞中 Na⁺/K⁺-ATPase 活力的计算

(1) 按蛋白浓度计算

定义：规定每小时每毫克组织蛋白中 Ca2+/Mg2+-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca2+/Mg2+-ATPase 活力(U/mg)=7.5×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

定义：规定每小时每克组织中 Ca2+/Mg2+-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca2+/Mg2+-ATPase 活力(U/g)=7.5×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

定义：规定每小时每 1 万个细菌或细胞中 Ca2+/Mg2+-ATPase 分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca2+/Mg2+-ATPase 活力(U/104)=0.015×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)

C 标准：标准管浓度，0.5 μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.25 mL；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万个。