丙酮酸(PA)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能检测 520 nm）
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

试剂盒组分

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Chromogen A：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Chromogen B：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

标准品制备：

标准曲线设置：按下表所示用 Extraction Buffer将 1 mg/mL标准溶液稀释至 70、35、17.5、8.75、4.375、2.188、1.094 µg/mL的标准液。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g组织，加入 1 mL Extraction Buffer匀浆，静置 30 min，4,000 g，常温离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g组织，加入 1 mL Extraction Buffer匀浆，然后超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），静置 30 min，4,000 g，常温离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞/细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加 1 mL Extraction Buffer，超声波破碎 5 min（功率 20%或 200W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），静置 30 min，4,000 g，常温离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）样品：取 100 μL血清（浆）加入 1 mL Extraction Buffer，充分混匀，静置 30 min，4,000 g，常温离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 520 nm，可见分光光度计用去离子水调零；
2. 样本测定（在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：

3.混匀，在 520 nm波长处测定各孔的吸光值 A。计算相对吸光值ΔA 测=A 测定-A 空白、ΔA 标=A 标准-A 空白。（空白孔只需做一管）

结果计算

1. 标准曲线的绘制：以标准液浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴，绘制标准曲线（浓度为 y轴更方便计算结果）。将ΔA 测带入方程计算出 y（µg/mL）。
2. 样本丙酮酸含量计算：

• (1) 按样本质量计算：
  丙酮酸含量(µg/g)=(y×V 样)÷(W×V 样÷V 提取)×n=y÷W×n
• (2) 按血清（浆）等液体体积计算：
  丙酮酸含量(µg/mL)=(y×V 样)÷(V 液×V 样÷V 提取)×n=10×y×n
• (3) 按照细菌或细胞数量计算：
  丙酮酸含量(µg/104)=(y×V 样)÷(500×V 样÷V 提取)×n=y÷500×n

V 样：加入的样本体积，0.075 mL；V 提取：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；W：样本质量，g；V 液：液体样本体积，0.1 mL；500：细菌或细胞数量，500万；n：稀释倍数。