乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 450 nm处的吸光度）
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

1×Assay Buffer: 使用前，Assay Buffer (5×)用去离子水稀释 5倍，浓度为 1×Assay Buffer，平衡到室温；4℃保存。

Lactate: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

NAD: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

WST-8: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

Enhancer: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。

Working Reagent：每孔准备 55 µL工作液，现配现用：吸取 31 µL 1×Assay Buffer，8 µL NAD, 5 µL WST-8, 1 µL Enhancer和10 μL Lactate混合均匀。

Lactate Dehydrogenase Standard (20 U/mL)：把 20 µL Lactate Dehydrogenase Standard (1 KU/mL)用 980 μL 1×Assay Buffer稀释至 20 U/mL，混合均匀；冰上避光放置；不稀释的标准品分装保存于-20℃。

标准曲线设置

按下表所示，用 1×Assay Buffer将 20 U/mL标准品稀释为 20、16、12、8、4、2、1 U/mL的标准溶液。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。

1. 动植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL预冷的 1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 15 min，取上清液，置冰上待测。

2. 细胞（菌）：收集 500万细胞（菌）到离心管内，用冷 PBS清洗细胞（菌），离心后弃上清，加入 1 mL 1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞（菌）5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 10,000 g，4℃离心 15 min，取上清液，置冰上待测。

3. 血清、血浆等液体样本：直接测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

3. 混匀后，37℃避光孵育 30 min，测定 450 nm处吸光度，空白孔记为 A 空，标准孔记为 A 标，测定孔记为 A 测。计算ΔA 测=A 测-A 空，ΔA 标=A 标-A 空。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测小于 0.001可适当加大样本量。如果ΔA 测大于 2.0，样本可用 1×Assay Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴，绘制标准曲线。

2. LDH含量的计算

将样本的ΔA 测代入方程得到 y值（U/mL）。

(1) 按样本鲜重计算

LDH含量 (U/g 鲜重)=y×V 样÷(W×V 样÷V 样总)×n=y÷W×n

(2) 按蛋白浓度计算

LDH含量 (U/mg 蛋白)=y×V 样÷(V 样×Cpr)×n=y÷Cpr×n

(3) 按样本体积计算

LDH含量 (U/mL)=y×V 样÷V 样×n=y×n

(4) 按细胞（菌）数量计算

LDH含量 (U/104 cells)=y×V 样÷(500×V 样÷V 样总)×n=y÷500×n

V 样：加入样本体积，0.05 mL；W：样本质量，g；V 样总：加入 1×Assay Buffer体积，1 mL；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞（菌）总数，500万。