氧基抗氧化能力(ORAC)检测试剂盒(荧光法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 荧光酶标仪（激发波长为 485 nm，发射波长为 525 nm）
• 全黑 96孔板
• 低温离心机、恒温箱
• 制冰机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水、丙酮

试剂盒组分

• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

1×Assay Buffer：使用前，Assay Buffer (2×)用去离子水稀释成 1×Assay Buffer，充分溶解待用。4℃保存。

1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用 1×Assay Buffer稀释成 1×Reagent I，充分溶解待用。用不完的 ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。不要储存稀释的 1×ReagentⅠ溶液。

Working ReagentⅡ：临用前配制 19 mg/mL ReagentⅡ溶液，现用现配。例如，称量 19 mg ReagentⅡ加入 1 mL 1×Assay Buffer，充分溶解待用。Working ReagentⅡ溶液不稳定，应立现配现用。

注意：ReagentⅠ和 ReagentⅡ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

Trolox Standard (5 mM)：使用前，用 1×Assay Buffer稀释成 0.2 mM浓度，充分溶解待用。用不完的 Trolox Standard（5 mM）-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存。

1. 动物组织：称取 0.01-0.1 g样本，加入适量的 1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取 0.01-0.1 g样本，加入适量的 1×Assay Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 100-500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入适量的 1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血浆或血清：用 1×Assay Buffer稀释 100倍或更多进行检测。
5. 液体样本：10,000 g，4℃离心 10 min，去除微粒，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。
6. 亲脂性样本：溶于 100%丙酮中，用 50%丙酮稀释，在室温下孵育 1 h，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。
7. 固体或高蛋白样本：称取固体样本，加入去离子水（1:2，w/v），冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去离子水洗涤，将此洗涤液与水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用 1×Assay Buffer稀释并直接用于分析。而不溶物部分加入纯丙酮（1:4, w/v）在室温下混合 30-60 min来进一步提取。10,000 g，4℃离心 10 min，取丙酮提取物的上清液用 50%丙酮稀释。通过将水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的结果相结合，计算出总 ORAC值。

注意：该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1502的测定。

实验步骤

1. 荧光酶标仪预热到 37℃，激发波长为 485 nm，发射波长为 525 nm。
2. 操作表（下述操作在全黑 96孔板中操作）：

混匀，37℃孵育 30 min

3. 混匀，立即用荧光酶标仪读取荧光值，每 5 min读取 1次，总共 60 min。荧光酶标仪的测定条件为激发波长为 485 nm，发射波长为 525 nm，仪器温度保持在 37℃。

注意：空白孔和标准孔只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。空白孔的最终测定值应小于初始值的10%。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

ORAC值根据荧光衰减曲线下净面积(Area Under the Curve, AUC)=[AUC待测样(抗氧化剂) - AUC(空白)]计算抗氧化剂的活性。

1. 从下面的等式计算 AUC

AUC=1+RFU₁/RFU₀+RFU₂/RFU₀+RFU₃/RFU₀+……+RFU₅₉/RFU₀+RFU₆₀/RFU₀

RFU₀=0 min的相对荧光值。

RFU_x=x min的相对荧光值。（例如，RFU₅是 5 min时的相对荧光值）

2. 计算净 AUC：Net AUC=AUC(样本)-AUC(空白)。
3. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为 y轴，净 AUC为 x轴，绘制标准曲线。
4. 将样本的 Net AUC 带入方程得到 y值（μM），以微摩尔每升 Trolox当量（TE）或每克样品的 TE（μmol TE/ g或μmol TE/ L）表示 ORAC 值。

注意：若样本进一步稀释，则需要再乘以进一步稀释的稀释倍数 n。