谷氨酸(Glu)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 570 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机，水浴锅，制冰机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Chromogen Solution：使用前，每瓶 Chromogen加入 10 mL去离子水；平衡到室温；4℃避光保存。用不完的试剂，4℃避光保存一周。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，常温离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，常温离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 发酵液样本：取 0.1 mL发酵液，加入 0.9 mL Extraction Buffer，混匀。8,000 g，常温离心 10 min，取上清，置冰上待测。
4. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL预冷的 Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，常温离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
5. 血清（浆）：取 0.5 mL血清（浆），加入 0.5 mL Extraction Buffer，混匀。8,000 g，常温离心 10 min，取上清，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 570 nm。可见分光光度计用去离子水调零。
2. 谷氨酸的含量测定（下述操作在 EP管中操作）：

3. 混匀，沸水浴 20 min（盖紧，以防止水分散失），冷却至室温后，取 200 μL至 96孔板或微量玻璃比色皿测定 570 nm处吸光度，测定管记为 A 测，空白管记为 A 空，计算ΔA=A 测-A 空。

注意：空白管只需测定 1次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测小于 0.02可适当加大样本量。为提高检测灵敏度，样本的ΔA 测应小于 1.5，若大于 1.5，则需要将上清液用 Extraction Buffer稀释至适当倍数后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准条件下测定回归方程为 y=0.0037x-0.5255；x为谷氨酸含量（µg/mL），y为吸光值。

2. 谷氨酸（Glu）含量的计算

1. 按照发酵液体积计算
   谷氨酸含量(μg/mL)=[(ΔA+0.5255)÷0.0037]×10=2,703×(ΔA+0.5255)
2. 按照血清（浆）液体体积计算
   谷氨酸含量(μg/mL)=[(ΔA+0.5255)÷0.0037]×2=540.6×(ΔA+0.5255)
3. 按照组织蛋白浓度计算
   谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(ΔA+0.5255)÷0.0037×V 样]÷(V 样×Cpr)=270.3×(ΔA+0.5255)÷Cpr
4. 按照样本质量计算
   谷氨酸含量(µg/g鲜重)=[(ΔA+0.5255)÷0.0037×V 样]÷(W×V 样÷V 样总)=270.3×(ΔA+0.5255) ÷W
5. 按照细胞数量计算
   谷氨酸含量(µg/104)=[(ΔA+0.5255)÷0.0037×V 样]÷(500×V 样÷V 样总)=270.3×(ΔA+0.5255) ÷500

V 样：加入反应体系中样本体积，0.25 mL；V 样总：提取体系体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞数量，5×106；10：发酵液的稀释倍数；2：液体样本的稀释倍数。