谷草转氨酶(AST/GOT)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 505 nm处的吸光度）
• 水浴锅、制冰机、低温离心机
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

标准品准备

按下表混合 Standard和 ReagentⅠ，得到相应浓度的标准品。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）：直接测定。

注意：如需样本蛋白浓度测定，推荐使用 Abbkine BCA法蛋白质定量试剂盒，货号为 KTD3001。该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1410（谷丙转氨酶）的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 505 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂：

混匀后，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 30 min

混匀后，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 20 min

3. 混匀，室温静置 10 min，在 505 nm波长处测各孔的 OD值，记为 OD 测定、OD 对照、OD 标准, 计算ΔOD 测定=OD 测定-OD 对照、ΔOD 标准=OD 标准-OD 空白。

注意：每个样本均需要做对照孔。0 µmol/mL标准孔为空白孔。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。2. 如果ΔOD测大于浓度为 1.5 μmol/mL标准品的ΔOD 标，则需要用 Extraction Buffer稀释样本后，重新检测。如果样本的ΔOD测低于 0.05 μmol/mL标准品的ΔOD 标，可提高样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

标准曲线的绘制：以标准液浓度为 y 轴，ΔOD 标准为 x轴，绘制标准曲线。将ΔOD 测定带入方程计算出 y（µmol/mL）。

1. 血清（浆）GOT的活性

单位定义：每小时每 mL血清样品催化产生 1 µmol丙酮酸的量为一个 GOT活力单位。

GOT(U/mL)=y×(V 样本+VReagentⅠ)÷V 样本÷T=12y

2. 组织、细菌或细胞 GOT的活性

(1) 按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每小时每 mg组织蛋白催化产生 1 µmol丙酮酸的量为一个 GOT活力单位。

GOT(U/mg prot)=y×(V 样本+VReagentⅠ)÷(Cpr×V 样本)÷T=12y÷Cpr

注意：此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位定义：每小时每 g鲜重样品催化产生 1 µmol丙酮酸的量为一个 GOT活力单位。

GOT(U/g 鲜重)=y×(V 样本+VReagentⅠ) ÷ (W×V 样本÷V 样总)÷T=12y÷W

(3) 按细菌或细胞数量计算：

单位定义：每小时每 104个细菌或细胞催化产生 1 µmol丙酮酸的量为一个 GOT活力单位。

GOT(U/104)=y×(V 样本+VReagentⅠ)÷(500÷V 样本÷V 样总)÷T=0.024y

V 样本：样本体积，0.005 mL；VReagentⅠ：加入 RegentⅠ体积，0.025 mL；V 样总：Extraction Buffer体积，1 mL；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，0.5 h；500：细菌或细胞总数量，500万个。