通用型免疫荧光(IF)工具箱(抗兔Dylight 488)

1.脱蜡至水化：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15 min，二甲苯Ⅱ 15 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，85%酒精 5 min，75%酒精 5 min，去离子水洗5 min。

2.抗原修复：切片置于盛满EDTA Antigen Retrieval Solution pH 8.0 (1×)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8 min，停火8 min，转中低火，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将切片置于PBS中在摇床上洗3次，每次3 min。

注意：修复液和修复条件根据组织来确定，最佳加热时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索。

3.画圈：切片稍甩干后，用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）。

4.封闭：在圈内滴加一滴Goat Serum Blocking Buffer，室温孵育30 min。

5.一抗：轻甩Goat Serum Blocking Buffer，在圈内滴加用Antibody Dilution Buffer稀释好的一抗，于湿盒内室温孵育1 h或4℃孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

注意：荧光共定位检测可先孵育完第一种一抗，洗弃非特异性结合的抗体后，换另一种一抗进行第二轮孵育。

6.荧光二抗：切片置于Antibody Wash Buffer中，置于摇床上清洗2次，每次5 min，再置于PBS中，摇床上清洗1次，5 min。切片稍甩干后，在圈内滴加Antibody Dilution Buffer稀释好的二抗，避光室温孵育1 h。

注意：加荧光二抗后，后续所有操作步骤都应在暗处进行。荧光共定位检测可孵育完对应的第一种二抗，洗去非特异性结合的抗体后，换另一种对应的二抗进行第二轮孵育。

7.DAPI复染：切片置于Antibody Wash Buffer中，置于摇床上清洗2次，每次5 min，再置于PBS中，摇床上清洗1次，5 min。在圈内滴加1×DAPI Staining Solution，避光孵育5-10 min，吸弃未反应的1×DAPI Staining Solution，PBS洗3次，每次5 min。

8.封片：用吸水纸吸干切片上的液体，用SuperKine™ Enhanced Antifade Mounting Medium封片，尽量避免气泡，荧光显微镜观察。

1.固定：载玻片用防脱片剂处理（Poly-L-Lysine），抗凝血经离心分层后涂片；冰冻切片室温风扇吹干；细胞爬片生长。以24孔板细胞爬片为例，吸尽培养液，加入1 mL固定液，室温固定15-30 min，吸弃固定液，PBS洗3次，每次3 min。

注意：推荐使用4%多聚甲醛作为固定液，也可根据特定的一抗或样品采用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。

2.破膜：加入1 mL Immunostaining Permeabilization Buffer室温孵育20 min，吸弃未反应的Immunostaining Permeabilization Buffer，PBS洗3次，每次3 min。

注意：冰冻切片也可选用含20 μg/mL蛋白酶K的PBS溶液，消化15 min。

3.封闭：吸弃PBS，加入200 μL Goat Serum Blocking Buffer，室温孵育30 min。

4.一抗：吸弃Goat Serum Blocking Buffer，加入200 μL用Antibody Dilution Buffer稀释好的一抗，于湿盒内，室温孵育1 h或4℃孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

注意：荧光共定位检测可孵育完第一种一抗，洗弃非特异性结合的抗体后，换另一种一抗进行第二轮孵育。

5.荧光二抗：吸弃一抗，加入1mL Antibody Wash Buffer，置于摇床上清洗3次，每次5 min，再加入1 mL PBS，置于摇床上清洗1次，5 min。吸弃PBS，加入200 μL用Antibody Dilution Buffer稀释好的二抗，避光室温孵育1 h。

注意：加荧光二抗起，后续所有操作步骤都应在较暗处进行。荧光共定位检测可孵育完对应的第一种二抗，洗去非特异性结合的抗体后，换下一种对应的二抗进行第二轮孵育。

6.DAPI复染：吸弃二抗，加入1 mL Antibody Wash Buffer，在摇床上洗2次，每次5 min，再加入1 mL PBS，在摇床上洗1次，5 min。吸弃PBS，加入500 μL 1×DAPI Staining Solution，避光孵育5-10 min，吸弃1×DAPI Staining Solution，PBS洗3次，每次5 min。

7.封片：滴一滴SuperKine™ Enhanced Antifade Mounting Medium于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡，荧光显微镜观察。

1.收集细胞：300 g离心5 min，收集细胞，吸弃上清后轻轻弹散细胞。

2.固定：加入0.5 mL固定液，轻柔悬浮细胞，室温固定15-30 min，300 g离心5 min，吸弃固定液，PBS洗3次，每次3 min。

3.破膜：加入0.5 mL Immunostaining Permeabilization Buffer，轻柔悬浮细胞，室温孵育20 min，300 g离心5 min，吸弃Immunostaining Permeabilization Buffer，PBS洗3次，每次5 min。

4.封闭：300 g离心5 min，吸弃PBS，用100 μL Goat Serum Blocking Buffer悬浮细胞，室温封闭30 min。

5.一抗：300 g离心5 min，吸弃Goat Serum Blocking Buffer，用100 μL Antibody Dilution Buffer稀释好的一抗重悬细胞，室温孵育1 h或4℃孵育过夜（推荐使用垂直混匀仪）。

注意：荧光共定位检测可孵育完第一种一抗，洗弃非特异性结合的抗体后，换另一种一抗进行第二轮孵育。

6.二抗：300 g离心5 min，吸弃一抗，加入0.5 mL Antibody Wash Buffer，清洗3次，每次5 min，再加入0.5 mL PBS，清洗1次，5 min。300 g离心5 min，吸弃PBS，加入100 μL Antibody Dilution Buffer稀释好的二抗重悬细胞，避光室温孵育1 h。

注意：加荧光二抗起，后续所有操作步骤都应在较暗处进行。荧光共定位检测可孵育完对应的第一种二抗，洗去非特异性结合的抗体后，换另一种对应的二抗进行第二轮孵育。

7.DAPI复染：300 g离心5 min，吸弃二抗，加入0.5 mL Antibody Wash Buffer，清洗3次，每次5 min，再加入0.5 mL PBS，清洗1次，5 min。300 g离心5 min，吸弃PBS，加入200 μL 1×DAPI Staining Solution重悬细胞，避光孵育5-10 min，离心吸弃1×DAPI Staining Solution，PBS洗3次，每次5 min。

8.封片：300 g离心5 min，吸弃大部分PBS，保留约50 μL液体，轻柔悬浮细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞均匀分布，稍晾干后，滴一滴SuperKine™ Enhanced Antifade Mounting Medium封片，尽量避免气泡，荧光显微镜观察。