半胱氨酸(Cys)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

试剂盒组分

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 600 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿
• 低温离心机、制冰机、恒温箱
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水、磷酸
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Chromogen Reagent：使用前 1天配置，Chromogen加入 3 mL去离子水充分溶解后，再加入 0.75 mL磷酸，混匀后盖紧（防止水分散失）沸水浴 2 h；冷却后加 12 mL去离子水，使用前平衡到室温；4℃避光保存。用不完的试剂，置于 4℃避光条件下可保存 2周。

Working Cys Standard：临用前配制，加 8.264 mL去离子水，充分溶解，配制成 10 μmol/mL标准品溶液，4℃避光保存（剩余的试剂，可置于 4℃避光条件下保存 3天）。

标准曲线设置

按下表所示，用去离子水将 10 μmol/mL标准品稀释为 5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 μmol/mL的标准溶液。

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 11,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 液体样本：取 0.1 mL液体样本，加入 0.3 mL Extraction Buffer，混匀。11,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 600 nm，可见分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

3. 混匀后室温静置 15 min，测定 600 nm处吸光度，空白孔记为 A 空，标准孔记为 A 标，测定孔记为 A 测。计算ΔA 测=A 测-A 空，ΔA 标=A 标-A 空。

注意：空白孔只需测定 1次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测小于 0.001可适当加大样本量。如果ΔA 测大于 1.5，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴，绘制标准曲线。

2. 半胱氨酸（Cys）含量的计算：将样本的ΔA 测代入方程得到 y值（μmol/mL）。

1. 按液体样本的计算：
   半胱氨酸(Cys)含量(µmol/mL)=4×y
2. 按鲜重计算：
   半胱氨酸(Cys)含量(µmol/g 鲜重)=y×V 样总÷W=y÷W
3. 按细胞/细菌数量计算：
   半胱氨酸(Cys)含量(μmol/104)=y×V 样总÷500=y÷500
4. 按按照蛋白质浓度计算：
   半胱氨酸(Cys)含量(µmol/mg prot)=y÷Cpr

4：液体样本提取时的稀释倍数；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞/细菌数量，500×104。