NAG 活性测不出来 / 差异不明显怎么办？亚科因NAG活性检测试剂盒常见问题汇总
本文针对CheKine™ N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）活性检测试剂盒（微量法，货号：KTB1326） 的日常使用，整理出常见问题和优化建议，帮助你提高一次成功率，减少重复实验。
一、信号太弱：ΔA 测定＜0.02
现象：
测定孔与对照孔的差值（ΔA 测定 = A测定 − A对照）很小，接近空白，甚至无差异。
可能原因 & 解决方案
- 样本中 NAG 含量偏低 / 稀释过度
- 检查是否对样本做了稀释，或取样量太少。
- 说明书建议：若 ΔA 测定 < 0.02，可适当增加上样量 或提高样本浓度。
建议：
- 组织样本：
- 称取组织量可略增加，如 0.1 g → 0.15–0.2 g，仍加入 1 mL Extraction Buffer 匀浆。
- 细胞/细菌样本：
- 细胞数/菌数适当增加；如原本 500 万，可增加到 800–1,000 万。
- 血清/浆样本：
- 在允许范围内适量增加加样体积（前提是反应体系比例不被严重打乱，可先做小范围预实验）。
- 样本保存不当导致活性降低
- 多次冻融、解冻时间过长、解冻温度过高都会造成 NAG 活性下降。
建议：
- 尽量使用新鲜样本；不能立即测定时，-80℃ 保存，避免反复冻融。
- 解冻过程控制在 4 小时内完成，避免常温久置。
- 分装保存样本，避免每次取用造成多次冻融。
- 反应条件不足
- 反应温度、时间不足，导致底物转化量低。
建议：
- 确认 37℃ 反应足够稳定（水浴锅或恒温设备已预热至少 30 min）。
- 标准推荐：37℃ 反应 30 min；如样本活性非常低，可在预实验中适度延长反应时间（如 40–45 min），但需保证所有样本组一致，以便对比。
- 试剂配制/保存问题
重点检查：
- Reagent I 是否按说明用去离子水充分溶解，且未变色、无沉淀。
- Reagent I 配制后是否长期常温放置或多次反复冻融（建议：-20℃ 避光，1 个月内用完）。
- Standard（对硝基苯酚标准溶液）是否为当次新配的稀释液，且在 4 h 内使用完毕。
若标准孔 ΔA 标准 也偏低，需优先怀疑试剂和反应体系，而不是样本。
二、信号太强：ΔA 测定＞1.6
现象：
测定孔吸光度接近或超过 1.6，甚至接近酶标仪线性范围上限，导致结果不准确。
解决方案
说明书建议：
- 用去离子水进一步稀释样本，同时平行设置对照孔；
- 或减少提取用样本量（例如组织取样少一些，或细胞数量减少）。
注意：
- 如果样本有稀释，一定要在最终计算结果时乘以样本稀释倍数。
- 对于细胞/细菌样本，计算 U/10⁴ 时要用真实细胞/细菌总数（考虑稀释）。
三、空白孔 / 标准孔 / 对照孔设置不当
1. 各类孔的作用回顾
根据说明书操作表：
| 试剂 | 空白孔(µL) | 标准孔(µL) | 测定孔(µL) | 对照孔(µL) |
|---|---|---|---|---|
| Reagent Ⅰ | 0 | 0 | 25 | 0 |
| Reagent Ⅱ | 35 | 35 | 35 | 35 |
| Standard | 0 | 10 | 0 | 0 |
| 去离子水 | 35 | 25 | 0 | 25 |
| 样本 | 0 | 0 | 10 | 10 |
| 37℃ 反应 30 min 后加入：Reagent Ⅲ 130 µL 到每孔 |
- 空白孔：没有底物 Reagent I，也没有标准或样本，只含 Reagent II + 水，用来扣除体系本底吸光度。
- 标准孔：含 Reagent II + Standard + 水，用来校准“吸光度变化 ≈ 对硝基苯酚生成量”的关系。
- 测定孔：含 Reagent I + Reagent II + 样本，发生完整酶促反应。
- 对照孔：无 Reagent I，仅 Reagent II + 样本 + 水，用来扣除样本本身的背景吸光度。
2. 常见错误
- 忘记做对照孔
- 导致 A测定 直接叠加了样本自身在 400 nm 的吸光信号，不利于准确反映酶促反应产生的对硝基苯酚。
建议：始终为每个样本至少设置测定孔 + 对照孔 各 1 个，尤其是颜色较深（如血清、血浆、部分组织匀浆）的样本。
- 空白孔只用水，未加入 Reagent II
- 正确做法：空白孔需含有 Reagent II + 水，才是真正的“体系空白”。
- 标准孔配制错误
- 未按要求将 Standard 先稀释 8 倍至 0.625 μmol/mL；
- 使用过了 4 小时时限的稀释标准液；
- 标准孔体积配置不符合表格（Standard 10 µL + Reagent II 35 µL + 水 25 µL）。
若发现 ΔA 标准 异常（过小、过大或不稳定），应首先核对标准孔的配制与试剂保存状况。
四、读数异常：数据波动大 / 重复性差
1. 吸光度差异大、重复孔不一致
可能原因：
- 加样不准确，移液枪校准不良；
- 孔间混匀不一致；
- 96 孔板边缘效应（靠边孔蒸发略快，温度波动大）。
优化建议：
- 使用校准合格的移液器，尽量使用同一型号与同一操作者完成全板加样。
- 加样后立即轻轻拍打或短暂震荡混匀，避免局部浓度不均。
- 尽量避开使用 96 孔板最外圈作为关键数据孔，或在边缘孔加 PBS 以缓和边缘效应。
- 反应时间要严格统一，避免某些孔多反应 2–3 min。
2. 整体吸光度偏高/偏低
先排查：
- 酶标仪或分光光度计是否有漂移；
- 400 nm 滤光片或设置是否错误；
- 是否用去离子水正确调零。
五、样本前处理中的常见问题
1. 组织样本
标准操作：
0.1 g 组织 + 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，15,000 g，4℃ 10 min，取上清。
常见错误：
- 匀浆不充分：底物和酶接触不充分，活性偏低。
- 未全程冰上操作：酶易失活。
- 离心条件不足（转速不够或时间太短）：导致杂质、脂类残留，影响 A400。
建议：
- 匀浆时始终保持冰浴，必要时分次匀浆避免温度升高。
- 确认离心机已达到15,000 g，4℃，10 min。
- 取上清时避免吸入沉淀。
2. 细胞 / 细菌样本
标准操作：
收集 500 万细胞/细菌 → PBS 洗涤 → 加 1 mL Extraction Buffer → 冰浴超声破碎 30 次（超声 3 s / 间隔 7 s，功率 20%或 200 W）→ 15,000 g，4℃，10 min → 取上清。
常见错误与优化：
- 超声时间过短或次数不足 → 裂解不完全，酶释放不充分；
- 超声时间过长连续进行 → 产生热量，导致酶失活。
建议：
- 严格采用“短脉冲 + 间歇”模式（3 s 超声 + 7 s 间隔），全程冰浴；
- 若怀疑裂解不充分，可取少量样本在显微镜下观察细胞完整性，适当增加超声次数。
3. 血清（浆）等液体样本
**特点：**可直接检测，无需裂解。但蛋白、色素等背景较高，对照孔尤为重要。
注意：
- 避免血样溶血，溶血会带来强背景和干扰。
- 保存时尽量分装，减少冻融。
- 对照孔的 A对照 偏高是正常现象，最终用 ΔA 测定 = A测定 − A对照 来消除背景。
六、试剂保存与稳定性问题
1. 各组分保存要点
- Extraction Buffer：4℃ 保存，即用型，用前平衡至室温。
- Reagent I：
- 48T 加 1.5 mL，96T 加 3 mL。
- 使用前用去离子水溶解：
- 溶解后 -20℃ 避光，可保存 1 个月；避免反复冻融。
- Reagent II / III：4℃ 保存，用前平衡至室温，即用型。
- Standard（对硝基苯酚）：
- 原液 5 μmol/mL，4℃ 避光保存；
- 使用前稀释 8 倍至 0.625 μmol/mL，当日现配，用于 4 h 内实验。
典型错误：
- Reagent I 与 Standard 长时间室温放置或强光下暴露 → 活性降低或降解。
- Reagent II / III 冷热交替剧烈，导致性能变化。
2. 发现哪些现象需要更换试剂？
- Reagent I 溶液出现异常沉淀、明显浑浊或变色；
- Reagent II / III 颜色改变或出现沉淀；
- 标准孔 ΔA 标准 波动明显，且更换样本无明显改善时，可考虑重新配制 Standard 或更换试剂盒。
七、结果计算中的常见问题
说明书提供了 4 种计算方式，核心都基于：
NAG 活性与 ΔA 测定 / ΔA 标准 成正比，换算到 nmol/min，再按蛋白量、鲜重、细胞数或体积归一化。
通用参数（用于推导）：
- C 标准 = 0.625 μmol/mL
- V 样总 = 1 mL（提取液体积）
- V 样 = 0.01 mL（加入反应体系的样本体积）
- T = 30 min
1. 常见错误点
- 忘记乘以样本稀释倍数
- 如果前处理中对样本做了稀释（例如 2 倍、5 倍），计算出的 NAG 活性需要乘回相应稀释倍数。
- 单位换算错误
- 注意 1 μmol = 1000 nmol，说明书已将此换算纳入常数1,000中，最终简化为20.83 这一系数。
- 不需要重复再乘或再除一个 1,000。
- 按蛋白量计算时 Cpr 用错
- Cpr 必须是mg/mL；
- 若 BCA 测得的单位是 μg/μL，需要先换算到 mg/mL（1 μg/μL = 1 mg/mL）。
2. 各种计算方式简要回顾
- 按蛋白浓度：U/mg prot
NAG (U/mg prot) = 20.83 × ΔA 测定 ÷ ΔA 标准 ÷ Cpr
- 按样本鲜重：U/g 鲜重
NAG (U/g 鲜重) = 20.83 × ΔA 测定 ÷ ΔA 标准 ÷ W
- 按细胞 / 细菌数：U/10⁴
NAG (U/10⁴ cells 或 bacteria) = 20.83 × ΔA 测定 ÷ ΔA 标准 ÷ n
（n 为细胞/细菌数量，单位是 10⁴ 个）
- 按液体体积：U/mL
NAG (U/mL) = 20.83 × ΔA 测定 ÷ ΔA 标准
建议：
在实验记录本中写清楚：
- 样本是否有额外稀释倍数；
- 计算采用的是哪一种方式（按蛋白、按鲜重、按体积或按细胞数）。
八、标准品毒性与安全问题
Standard（对硝基苯酚）注意事项：
- 有毒且有刺激性气味。
- 建议在通风橱内操作，佩戴手套和实验服。
- 若不慎接触皮肤或眼睛，立即用大量清水冲洗，并遵循实验室安全规范。
九、综合优化建议
- 正式实验前，务必做 2–3 个预期差异较大的样本预实验，用于：
- 确认信号范围适中（ΔA 测定 在 0.1–1.2 之间较理想）；
- 调整样本量或稀释倍数。
- 用好对照孔和空白孔
- 对于颜色深、背景高的样本，对照孔尤其重要。
- 空白孔、标准孔一般做 1–2 个即可，但要保证配置无误。
- 严格把控温度与时间
- 酶标仪 / 分光光度计预热 ≥30 min，波长 400 nm；
- 37℃ 反应时间统一为 30 min（如需优化，确保同批所有孔一致）。
