Pro 丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(荧光法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 荧光酶标仪(激发波长 520 nm，发射波长 550 nm)
• 96孔全黑板、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction BufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Extraction Buffer II：即用型；4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
• Working Reagent IV：临用前配制，将 Reagent II 全部转移至 Reagent IV 中，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 6个月，避免反复冻融。
• Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Working ReagentⅠ：每孔准备 600 µL工作液，现配现用。按照 Reagent III：Working Reagent IV=200 μL：400 μL的比例，混合均匀。
• Working Reagent II：每孔准备 600 µL工作液，现配现用。按照 Reagent III：Reagent V=200 μL：400 μL的比例，混合均匀。
• Standard (4.05 mmol/mL)：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：Reagent I、Reagent III、Reagent IV 和 Standard有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

标准品制备

100 nmol/mL Standard：20 µL 4.05 mmol/mL Standard用61 µL去离子水稀释得1 mmol/mL Standard；10 µL 1 mmol/mL Standard用 990 µL去离子水稀释得 10 µmol/mL Standard；10 µL 10 µmol/mL Standard用 990 µL去离子水稀释得 100 nmol/mL Standard；使用 100 nmol/mL Standard，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction BufferⅠ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS 清洗细胞，离心后弃上清，加入 0.4 mL Extraction Buffer II，混匀后放置在冰上裂解 5 min，每 2 min混匀一次，直接置于冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 荧光酶标仪预热 30 min以上，调节激发波长到 520 nm，发射波长到 550 nm。
2. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

混匀后，95℃水浴反应 50 min，取出后流水冷却，10,000 g离心 10 min，取 200 μL上清至 96孔全黑板，记录各孔的荧光值 RFU，荧光激发波长 520 nm，荧光发射波长 550 nm，空白孔记为 RFU 空白，标准孔记为 RFU 标准，测定孔记为 RFU 测定，对照孔记为 RFU 对照。计算ΔRFU 测定=RFU 测定-RFU 对照，ΔRFU 标准=RFU 标准-RFU 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。如果样本不存在溶血、脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本稀释成不同浓度做预实验，根据预实验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.04 -10 μM，选择合适的稀释倍数对样本进行检测。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为 x轴，ΔRFU 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU 测定带入方程得到 x (nmol/mL)。
2. MDA含量的计算：

• （1）按样本蛋白浓度计算
  
  MDA (nmol/mg prot)=x÷Cpr
• （2）按样本鲜重计算：
  
  MDA (nmol/g 鲜重)=x÷(W÷V1)=x÷W
• （3）按照细胞数量计算
  
  MDA (nmol/10⁴ cell)=x÷(n÷V2)=0.4x÷n
• （4）按样本体积计算：
  
  MDA (nmol/mL)=x

V1：加入 Extraction BufferⅠ体积，1 mL；V2：加入 Extraction Buffer II 体积，0.4 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细胞数量，以万计。

注意事项

1. 如果待测组织样本匀浆中存在絮状物，可多次离心取上清，避免测值不稳定，复孔差异大。
2. 每次检测都需要建立新的标准曲线。
3. 如果 RFU 测定较低或ΔRFU 测定为负值，可适当增加样本量或延长反应时间，但不得超过 100 min。
4. 如果样本测不出值，建议取新鲜样本，重新检测。