总抗氧化能力(TAC)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 593 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• 1×Assay Buffer：临用前配制，Assay Buffer (10×)加去离子水稀释成 1×Assay Buffer。稀释好的 1×Assay Buffer可 4℃至少稳定保存两个月。
• Substrate Diluent：即用型；使用前平衡至室温，4℃保存。
• Substrate：即用型；使用前平衡至室温，-20℃避光保存，避免反复冻融。
• Reaction Buffer：即用型；使用前平衡至室温，-20℃避光保存，避免反复冻融。
• Working Ascorbic Acid (Positive control)：加入 1 mL稀释好的 1×Assay Buffer来溶解，混匀得到母液。然后取 0.1 mL母液加到 0.9 mL稀释好的 1×Assay Buffer中混匀。浓度是 0.1 mg/mL，4℃避光可保存一个月。

工作液的配制：临用前配制，将 Substrate Diluent、Substrate、Reaction Buffer按 10:1:1的比例混合，现配现用。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL 1×Assay Buffer，冰浴匀浆，转移到 1.5 mL EP管中，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液于新离心管中，置冰上检测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL 1×Assay Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），转移到 1.5 mL EP 管中，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液于新离心管中，置冰上检测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL 1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），转移到 1.5 mL EP管中，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液于新离心管中，置冰上检测。
4. 血清、血浆或尿样：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 593 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 样本测定（在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：

3. 充分混匀，室温反应 5 min，于 593 nm测定吸光值，计算ΔA 测=A 测定-A 空白（空白孔只需做 1个）。

结果计算

1. 总抗氧化能力计算标准曲线公式：y=4.4664x+0.0685，R²=0.9986，其中 y为 Fe²⁺终浓度(μmol/mL)，x为吸光值差值ΔA，将ΔA 测带入标准曲线公式，求得 y (μmol/mL)。
2. 样本中总抗氧化能力计算：

单位定义：样本的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值（ΔA）所需的标准液 Fe²⁺离子浓度（μmol/mL）表示。

1. 按样本鲜重计算

   总抗氧化能力(μmol/g鲜重)=y×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×n=19×y÷W×n

2. 按样本蛋白浓度计算

   总抗氧化能力(μmol/mg prot)=y×V 反总÷(V 样×Cpr)×n=19×y÷Cpr×n

3. 按细胞或细菌数量计算

   总抗氧化能力(μmol/10⁴)=y×V 反总÷V 样×V 样总÷细胞或细菌数量×n=19×y÷细胞或细菌数量×n

4. 按液体体积计算

   总抗氧化能力(μmol/mL)=y×V 反总÷V 样×n=19×y×n

V 反总：反应总体积，0.19 mL；V 样：反应中样品体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；W：样品质量，g；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞或细菌数量：以 10⁴为单位。