超氧阴离子清除能力检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 450 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机
• 去离子水、裂解液（50 mM 磷酸钾（按 0.05 mol/L K2HPO4：0.05 mol/L KH2PO4= 80.2：19.8的比例配制; pH 7.4)，0.1 mM EDTA，0.5% Triton X-100）
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Assay Buffer: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Sample Diluent: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• WST-8: 即用型；实验过程中，冰上避光放置；分装-20℃避光保存。
• Enhancer: 即用型；实验过程中，冰上避光放置；分装-20℃避光保存。
• Working Xanthine Oxide： 稀释前先摇匀；在洁净离心管中用 Sample Diluent按照阳性对照和样本的需要量进行 200倍稀释。实验过程中，冰上避光放置；分装-20℃保存。
• Xanthine: 即用型；实验过程中，冰上放置；分装-20℃保存。Xanthine可能看起来是浑浊的。移液前，先将试管涡旋。
• Working Reagent： 对于 96孔板，每孔准备 85 µL Working Reagent，74 μL Assay Buffer，5 μL Xanthine，5 μL WST-8和 1 μL Enhancer，现配现用。

样本制备

1. 动物组织：冰上预冷的 PBS洗涤组织后，去除所有的红细胞，用 1 mL/0.1 g的预冷裂解液（50 mM 磷酸钾，0.1 mM EDTA，0.5% Triton X-100）匀浆组织，4℃，12,000 g离心 5 min。取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL预冷的裂解液（50 mM 磷酸钾，0.1 mM EDTA，0.5% Triton X-100）捣碎，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞样品: 收集 5×106个细胞，用预冷的 PBS洗涤细胞，离心并弃去上清液。将细胞重悬于 1 mL冰冷裂解缓冲液（50 mM磷酸钾，0.1 mM EDTA，0.5% Triton X-100）中，冰上孵育 10 min，然后 12,000 g，4℃离心 5 min。取上清液，置冰上待测。
4. 血液样本：使用标准规程收集血清或血浆（肝素，柠檬酸盐或 EDTA），直接检测。红细胞沉淀可以在 5倍体积的冰冷去离子水中溶解；12,000 g离心 5 min以沉淀红细胞膜。在超氧阴离子清除试验之前，红细胞裂解液（1:100）。
5. 药物：稀释至一定浓度。例如 1 mg/mL。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中加入如下试剂：

3. 混匀，立即读取 450 nm处的吸光度值 A0，室温（25℃）避光孵育 60 min，再次读取 450 nm处的吸光度值 A60，计算∆A = A60–A0，分别记为∆A 空，∆A 对，∆A 测，计算∆∆A 对=∆A 对-∆A 空，∆∆A 测=∆A 测-∆A 空。

结果计算

超氧阴离子清除率计算公式：D% =(∆∆A 对-∆∆A 测)÷∆∆A 对×100%