Pro 过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒(荧光法)-CheKine™

自备耗材

• 荧光酶标仪（激发波长为 535 nm，发射波长为 587 nm）
• 全黑 96孔板、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、恒温箱、制冰机
• 去离子水，PBS (pH 7.0)
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
• ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。
• H2O2 ReagentⅢ：临用前配制；取 5 μL ReagentⅢ加入 4.995 mL去离子水，混匀，取 15 μL稀释后的 ReagentⅢ，加入 4.395 mL Assay Buffer，混匀，现用现配，按需配制，当天内使用。
• Working Reagent：临用前避光配制；取 50 μL ReagentⅠ和 20 μL ReagentⅡ，加入 4.93 mL Assay Buffer，充分混匀，该体积可用 100次，按需配制，当天内使用，使用时须避光。
• Standard (1 M)：使用前，用去离子水稀释 10,000倍得到 0.1 mM标准品，充分溶解待用。用不完的 Standard (1 M) -20℃避光分装保存，避免反复冻融。

Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。

样本制备

1. 动植物组织：称取 0.1 g样本，加入 1 mL冷的 Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL冷的 Assay Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清或其他液体样本：10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 荧光酶标仪预热到 37℃，调节激发波长为 535 nm，发射波长为 587 nm。
2. 操作表（下述操作在全黑 96孔板中操作）：

酶标仪上振板 10 s，37℃反应 5 min

混匀，室温避光静置 10 min，荧光酶标仪上设置激发波长 535 nm，发射波长 587 nm，测定各孔荧光值，分别记为 RFU 测定、RFU 对照、RFU 标准和 RFU 空白，计算ΔRFU 测定=RFU 对照-RFU 测定，ΔRFU 标准=RFU 标准-RFU 空白。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

   以标准溶液浓度为 x轴，ΔRFU 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU 测定带入方程得到 x (μM)。

2. CAT活性的计算：
   1. 按样本蛋白浓度计算：

      酶活单位定义：37℃条件下，每 mg蛋白每分钟分解 1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

      CAT(U/mg prot)=x×f÷5÷Cpr

   2. 按样本鲜重计算：

      酶活单位定义：37℃条件下，每 g组织每分钟分解 1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

      CAT(U/g 鲜重)=x×f÷5÷W

   3. 按照细胞数量计算

      酶活单位定义：37℃条件下，每 104个细胞每分钟分解 1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

      CAT(U/104 cell)=x×f÷5÷N

   4. 按液体体积计算：

      酶活单位定义：37℃条件下，每 mL液体每分钟分解 1 nmoL H2O2的量为一个活力单位。

      CAT(U/mL)=x×f÷5

   Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；5：反应时间，5 min；f：样本稀释倍数；W：样品质量，g；N：细胞总数，万。