蔗糖酶活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 520 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 水浴锅、分析天平、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 1 mL去离子水，96 T加入 2 mL去离子水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存一周。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

注意：Extraction和 Reagent I 有刺激性气味，Reagent IV有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Standard：临用前配制；加入 1 mL去离子水溶解，配成 10 mg/mL葡萄糖溶液备用，4℃可保存两周。

标准品制备：10 mg/mL葡萄糖溶液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

植物组织：按照组织质量（g）：Extraction Buffer体积（mL）为 1: 5-10的比例（建议称取约 0.1 g组织，加入 1 mL Extraction Buffer），进行冰浴匀浆。8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。

注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB3130、KTB3140、KTB3110的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 520 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：

混匀，置于 25℃准确水浴 10 min

混匀，置于 95℃水浴中 10 min（盖紧，以防止水分散失），冷却至室温

混匀，取 200 μL至微量玻璃比色皿或 96孔板，于 520 nm处测定吸光值，分别记为 A 对照、A 测定、A 标准和 A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：（1）标准曲线和空白只需测 1-2次，每个测定管需设一个对照管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.02可减小稀释倍数或适当加大样本量，如果ΔA 测定大于 1.2，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。（2）若要检测多个样本，需保证冷却时间一致。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (mg/mL)。

2. 蔗糖酶活性的计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化水解 1 μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶 (U/mg prot)=(1,000×x×V1)÷(Cpr×V1÷V2)÷T=100×x÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化水解 1 μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶 (U/g 鲜重)=(1,000×x×V1)÷(W×V1÷V2)÷T=100×x÷W

1,000：1 mg/mL=1,000 μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.03 mL；V2：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，10 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。