过氧化物酶(POD)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备仪器与试剂

试剂盒组分

*请在实验前检查各组分的量。

*各组分在规格基础上额外提供 10%的量用于进行标准曲线制作或预实验。

注意事项

• 正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
• 对于组织样本及细胞样本等，可通过测定蛋白浓度来进行样本间结果均一化。推荐使用亚科因货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）。
• 本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。如有疑问，可咨询本司技术人员（400-6800-830）。
• 建议实验者自行建立标准曲线以提高结果准确度。如未自行建立标准曲线，可参考结果展示部分的典型标准曲线公式进行结果计算。
• 生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。
• 本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

实验流程

试剂准备

试剂准备

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。

• 动物组织：用冷的 PBS 清洗动物组织，吸干组织上的水分，称取约 0.1 g组织样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8000 g，4℃离心 10 min，取上清液于新离心管中，置冰上待检测。

• 植物组织：用冷的 PBS 清洗植物组织，吸干组织上的水分，尽可能剪碎，称取约 0.1 g组织样本，加入 1 mL Extraction Buffer。对于植物纤维不多的植物组织冰浴匀浆，8000 g，4℃离心 10 min，取上清液于新离心管中，置冰上待检测；对于植物纤维较多的植物组织冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

• 细胞或细菌：收集 5×10⁶个细胞或细菌，用冷的 PBS 清洗细胞或细菌，800 g离心 2 min，弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

• 血清或血浆：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪准备：预热 30 min以上，调节波长到 470 nm。
2. 工作液的配制：每孔需要 190 μL工作液，临用前将 Extraction Buffer、Substrate、H2O2按照每孔 139 μL：50 μL：1 μL的比例混匀（按需要检测的样本数量进行计算，可多配一些以防不够）；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 10 min以上；现配现用。
3. 检测体系配制：在 96孔板中加入 10 μL样本和 190 μL工作液，混匀。
4. 吸光度检测：在 470 nm处读取 30 s时的吸光值 A1和 90 s时的吸光值 A2。

结果计算

自动计算

为帮助您更轻松、准确地完成相关计算，我们特在官网提供了“在线计算器小工具”。您无需手动计算，只需在网页上输入数值，即可快速获得可靠结果。访问方式：官网[https://www.abbkine.cn]>进入“技术中心”>查找“在线计算器”工具。

手动计算

以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。

1. 数据处理

计算ΔA 测定=A2-A1。

2. 样本 POD活性的计算

• 按样本质量计算

  活性单位（U）定义：每 g组织在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.005为一个酶活力单位。

  POD (U/g 鲜重)=ΔA 测定×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷0.005÷T×n=4000×ΔA 测定÷W×n

• 按细胞或细菌数量计算:

  活性单位（U）定义：每 10⁴个细胞或细菌在每 mL反应体系中每分钟 A470变化 0.005为一个酶活力单位。

  POD (U/10⁴)=ΔA 测定×V 反总÷(500÷V 样总×V 样)÷0.005÷T×n=8×ΔA 测定×n

• 按液体体积计算

  活性单位（U）定义：每 mL液体样本在每 mL反应体系中每分钟 A470 变化 0.005为一个酶活力单位。

  POD (U/mL)=ΔA 测定×V 反总÷V 样÷0.005÷T×n=4000×ΔA 测定×n

• 按蛋白浓度数量计算

  活性单位（U）定义：每 mg组织蛋白在每 mL反应体系中每分钟 A470 变化 0.005为一个酶活力单位。

  POD (U/mg prot)=ΔA 测定×V 反总÷(Cpr×V 样)÷0.005÷T×n=4000×ΔA 测定÷Cpr×n

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；W：样品质量，g；T：反应时间，1 min；n：样品稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌数量，以 10⁴为单位。