碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 680 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、恒温箱、制冰机、离心机、磁力搅拌器
• 去离子水
• 研钵或匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：Extraction Buffer有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Working Reagent I：临用前配制；取出 Reagent I，48 T加入 3 mL去离子水，96 T加入 6 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光可以保存 1周。

Working Reagent II：临用前配制；取出 Reagent II，48 T加入 5 mL Extraction Buffer，96 T加入 10 mL Extraction Buffer，沸水浴中磁力搅拌溶解（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 min，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用），用不完的试剂 4℃避光可以保存 1周。

Reagent III：临用前配制；取出 Reagent III，48 T加入 14 mL去离子水，96 T加入 28 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃可以保存 1 个月。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Stardard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。
2. 细菌或真菌：收集 500万细菌或真菌到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或真菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或真菌 3 min（功率 30%或 300 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 680 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. Working Reagent I、II、III 置于 40℃孵育 30 min。
3. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中进行）：

混匀后置于 40℃孵育 20 min

混匀后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，在新的 EP管中加入以下试剂：

混匀后置于 40℃孵育 20 min

4. 取 200 μL至微量玻璃比色皿或 96孔板中，记录 680 nm处吸光值，分别记为 A 测定、A 对照、A 标准、A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：每个测定管需设一个对照管，标准管和空白管只需做 1-2次。如果样本的ΔA 测定小于 0.01，可适当延长反应时间，即第一步水浴时间，最后计算酶活时对公式进行修改，如果样本的ΔA 测定大于 1.0，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，再进行实验，乘以最终的稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

AKP活性的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：40℃每 mg蛋白每分钟水解产生 1 μmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：40℃每 g样品每分钟催化水解产生 1 μmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（3）按照细菌或真菌数量计算

酶活单位定义：40℃每 104个细菌或真菌每分钟催化水解产生 1 μmol酪氨酸为 1个酶活单位。

（4）按样本体积计算：

酶活单位定义：40℃每 mL样品每分钟催化水解产生 1 μmol酪氨酸为 1个酶活单位。

C 标准：0.25 μmol/mL标准酪氨酸溶液；V 反总：酶促反应总体积，0.1 mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；V 反：加入反应体系中粗酶液体积，0.02 mL；V 提：加入 Extraction Buffer总体积，1 mL；T：催化反应时间，20 min；W：样品质量，g；n：细菌或真菌数量，万。