氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备仪器与试剂

注意事项

• 正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
• 对于组织样本及细胞样本等，可通过测定蛋白浓度来进行样本间结果均一化。推荐使用亚科因货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA法）。
• 本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。如有疑问，可咨询本司技术人员（400-6800-830）。
• 建议实验者自行建立标准曲线以提高结果准确度。如未自行建立标准曲线，可参考结果展示部分的典型标准曲线公式进行结果计算。
• 生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。
• 本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

实验流程

试剂准备

试剂准备

标准品配制

取 100μL 20 mM GSSG 标准品用 900 μL Diluted Extraction Buffer稀释得 2 mM GSSG标准品，取 10μL 2 mM GSSG 标准品用 990 μL Diluted Extraction Buffer 稀释得 20 µM GSSG 标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品。每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

• 动植物组织样本：请尽量使用新鲜的组织样本进行测定。称取 0.1 g组织样本，加入 1 mL预冷的 Extraction Buffer，快速冰上匀浆（匀浆器提前放冰上预冷）。匀浆后的样本，4℃，8000 g离心 10 min，取上清液置冰上待测。
• 血清、血浆样本：请尽量使用新鲜的血清（浆）进行测定。将收集的血清（浆）于 4℃，600 g离心 10 min，30 min内吸取上清液到另一试管中，加入等体积的 Extraction Buffer，4℃，8000 g离心 10 min，取上清液置冰上待测。
• 细胞或细菌样本：请尽量使用新鲜的细胞（菌）进行测定，而不要使用冻存的细胞（菌）进行测定。收集 5×10⁶个细胞（菌），用 1 mL预冷的 PBS 清洗细胞（菌）2次（PBS 重悬，4℃，600 g离心 10 min），加入 3倍细胞（菌）沉淀体积的 Extraction Buffer重悬细胞（菌），冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200W，超声 3 s，间隔 7s，重复 30次），4℃，8000 g离心 10 min，取上清液置冰上待测。细胞也可以使用冻融法提取，细菌不能使用，重悬的细胞反复快速冻融 2-3次（在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），4℃，8000 g离心 10 min，取上清液置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪准备：预热 30 min以上，调节波长到 412 nm。
2. 检测体系配制：在 1.5 mL EP 管中按照如下方式操作：该步骤必须在 1.5 mL EP管进行混匀，Inhibitor不可直接加在 96孔板中，会腐蚀孔板。Inhibitor 有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

3. 混匀后，37℃孵育 30 min，即为混合物。
4. 检测体系配制：在 96孔板中按照如下方式操作

5. 吸光度检测：充分混匀后，在 412 nm处读取吸光度值 A1，分别标记为 A1 空白、A1 标准和 A1 测定，37°C 避光孵育 10 min后，迅速在 412 nm处读取吸光度值 A2，分别标记为 A2 空白、A2 标准和 A2 测定。

结果计算

自动计算

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手动计算

以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。

1. 数据处理：计算ΔA=A2-A1，ΔΔA 标准=ΔA 标准-ΔA 空白, ΔΔA 测定=ΔA 测定-ΔA 空白。
2. 标准曲线绘制：以标准品浓度为 y轴，ΔΔA 标准为 x轴，绘制标准曲线。将ΔΔA 测定代入方程得到 y值（µM）。
3. 样本 GSSG含量计算：
   • 按样本质量计算：GSSG(nmol/g)=y×V 标准÷V 样×V 提取÷W×n=10×y÷W×n
   • 按细胞或细菌数量计算: GSSG(nmol/10⁴)=y×V 标准÷V 样×V 提取÷500×n=0.02×y×V 提取×n
   • 按液体体积计算：GSSG(nmol/mL)=y×V 标准÷V 样×2×n=20×y×n
   • 按蛋白浓度数量计算：GSSG(nmol/mg prot)=y×V 标准÷V 样÷Cpr×n=10×y÷Cpr×n