谷胱甘肽S-转移酶(GST)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Chromogen：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Substrate Working Reagent：使用前加入 2.4 mL离子水溶解；用不完的试剂 4℃避光保存可稳定 1个月。

样本制备

1. 动植物组织：称取 0.1 g组织样本，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 5×106细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mLAssay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，可见紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Substrate Working Reagent；置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育 15 min。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中按照如下方式加样：

4. 迅速混匀后于 340 nm测定吸光度变化，分别记录空白的 10 s为 A1，310 s为 A2；测定的 10 s和为 A3，310 s为 A4。计算ΔA 空=A2-A1，ΔA 测=A4-A3。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1 μmol/L CDNB与 GSH结合。

GST (U/mg prot)=0.46×(ΔA 测-ΔA 空)÷Cpr
2. 按样本鲜重计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1 μmol/L CDNB与 GSH结合。

GST (U/g 鲜重)=0.46×(ΔA 测-ΔA 空)÷W
3. 按细胞或细菌数量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 104个细胞或细菌每分钟催化 1 μmol/L CDNB与 GSH结合。

GST (U/104)=0.46×(ΔA 测-ΔA 空)÷500
4. 按液体体积计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1 μmol/L CDNB与 GSH结合。

GST (U/mL)=0.46×(ΔA 测-ΔA 空)

ε：产物摩尔消光系数，9.6×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁶：1 mol=1×10⁶ μmol；V_反总：反应体系总体积，220 μL=2.2×10^-4 L；C_pr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V_样：加入反应体系中上清液体积，20 μL=0.02 mL；V_样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；500：细胞或细菌数量，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。