谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Substrate：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• GR Cofactor：临用前配制；使用前每管加入 2.4 mL去离子水，混匀，现配现用，置于冰上；-20℃避光保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。

注意：1. 细胞中 GR活性测定时，细胞数目须在 3-5×106之间，细胞中 GR的提取时可加 Assay Buffer后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。

2. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

3. Assay Buffer含有一定浓度的蛋白（约 1 mg/mL），如需测定蛋白浓度要减去 Assay Buffer本身的蛋白含量。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Assay Buffer置于 25℃（普通物种）或者 37℃（哺乳动物）中预热 30min以上。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中按照如下方式加样：

充分混匀，在 340 nm处测定 10 s和 190 s的吸光值。空白孔记为 A1和 A2，测定孔记为 A3和 A4。ΔA 空= A1-A2，ΔA 测= A3-A4

注意：空白孔只需做 1个即可。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。确保 180 s内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用 Assay Buffer稀释 2~5倍。因通过反应速率计算酶活，使用 96孔 UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数。如果ΔA 测小于 0.02可适当加大样本量。如果ΔA 测大于 1.0，样本可用 Assay Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

(1) 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 25℃或 37℃，pH 8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1 µmol NADPH氧化。

(2) 按样本鲜重计算

活性单位定义：在在 25℃或 37℃，pH 8.0条件下，每克样品每分钟催化 1 µmol NADPH氧化。

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义：在 25℃或 37℃，pH 8.0条件下，每 104个细胞或细菌每分钟催化 1 µmol NADPH氧化。

(4) 按液体体积计算

活性单位定义：在 25℃或 37℃，pH 8.0条件下，每毫升液体每分钟催化 1 µmol NADPH氧化。

ΔA 空=A1-A2，ΔA 测=A3-A4；ε：NADPH摩尔消光系数 6.22×103 L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，200 μL=2×10-4L；106：1 mol=1×106 μmol；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20 μL=2×10-2 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；500：细胞或细菌数量，5×106。

B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。