糖原合酶活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm 处的吸光度）
• 96 孔板（UV 板）或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温箱、制冰机、离心机、超声破碎仪
• 去离子水
• 匀浆器

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
• Reagent V：临用前配制；48 T 加入 0.6 mL Reagent II，96 T 加入 1.2 mL Reagent II，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃避光保存一周，避免反复冻融。

Working Reagent：临用前将 Reagent III 和 Reagent IV 全部转移至 Reagent I 中，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃避光保存一周，避免反复冻融。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL 预冷的 Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 500 万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS 清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL 预冷的 Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 根据用量，按需将配制好的 Working Reagent 和 Reagent V 置于 37℃预热 5 min。
3. 在 96 孔板（UV 板）或 1 mL 微量石英比色皿中加入 10 μL 样本上清液、10 μL Reagent V 和 180 μL Working Reagent，立即混匀，记录 340 nm 处初始吸光值 A1 和 1 min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

结果计算

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

2. 按样本鲜重计算:

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

3. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 10⁴ 个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔 UV 板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。