SOD实验失败怎么办？抑制率过高 / 过低、背景大 4 大原因与处理建议

做 SOD 实验的人，基本都经历过下面这些瞬间：

• 抑制率一片贴顶：“全是 99%……这板还能要吗？”
• 抑制率接近 0：“好像没测出任何活性？”
• 背景 A 值莫名其妙很高：“样本对照跟空白几乎一样……”
• 同一组 5 个动物，数据乱成一锅粥：“到底是模型问题还是实验翻车？”

我们在整理**CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法，KTB1030）**用户反馈时，

发现大家失败时的“表现”差不多，背后的原因也高度集中。

这篇就从三个常见症状入手：

• 抑制率过高
• 抑制率过低
• 背景大、重复性差

对应拆出4 大根本原因 + 具体处理建议， 你可以直接当作**“SOD 故障排查小抄”** 用。

一、先对号入座：你的 SOD 实验属于哪一类“翻车”？

情况 1：抑制率集体偏高，接近 90–100%

典型表现：

• 多数样本的抑制率在 90% 以上，甚至接近 100%；
• 同一板上的空白 ΔA 正常，说明体系 OK；
• 各组之间差异反而不明显。

**直觉判断：**样本 SOD 活性对体系“压制过猛”，

要么样本太浓，要么上样量太大，要么孵育时间太长。

情况 2：抑制率接近 0 或为负值

典型表现：

• ΔA_sample 与 ΔA_blank 几乎一样，抑制率接近 0；
• 极端情况下，ΔA_sample 还比 ΔA_blank 大，抑制率为负；
• 实验设计上你预期会有明显变化，但数据完全看不出来。

**直觉判断：**样本中 SOD 活性很低 / 丢失，

或者本底没扣干净，计算公式用错。

情况 3：背景大、孔间差异乱，复孔不一致

典型表现：

• Sample Control（样本对照）A 值很高，甚至接近 Sample 孔；
• 同一组 5 只动物，抑制率和活性上下乱跳；
• 同一样本两孔差异很大，重复性差。

直觉判断：

样本前处理、配液、排板、加样等操作链条上出了问题，

而不一定是“试剂盒坏了”。

二、抑制率异常 / 背景大的 4 大根本原因

从 CheKine™ 用户的大量咨询里，绝大部分问题可以归到 4 类：

1. 样本环节出问题
• 冻存 / 解冻不规范，酶活被折腾没了；
• 匀浆不充分或者温度控制不好；
• 样本本身“太脏”（溶血、脂血、色素多）。
2. 稀释倍数 & 上样量不在线性范围
• 高活性样本稀释太少 → 抑制率集体贴顶；
• 活性本来就低，却还稀释过头 → 抑制率接近 0。
3. 试剂配制 / 孵育条件不当
• 工作液分批配、没混匀，孔与孔差异巨大；
• 试剂没充分回温、孵育温度/时间漂移。
4. 排板 / 计算环节出错
• 空白、样本对照孔设置不合理，导致本底扣不干净；
• 公式漏乘稀释倍数、混淆总体积与上样体积。

下面按“现象 → 可能原因 → 对策”的方式掰开讲。

三、抑制率过高：样本太“猛”，还是操作太“狠”？

关键词：“SOD 抑制率 过高”

1. 典型症状

• 多数样本抑制率 >90%，甚至接近 100%；
• 不同组之间差异被压扁，看不出梯度；
• 空白 ΔA 基本正常，说明体系显色没问题。

2. 核心原因

原因 1：样本太浓 / 上样量偏大

• 典型场景：年轻健康动物、抗氧化干预组、植物叶片等，SOD 活性本来就高；
• 你却照搬“低活性样本”的稀释倍数，上来就把体系压得死死的。

原因 2：孵育时间过长 / 温度偏高

• 超过说明书推荐：
• 比如该孵 30 min，你放了 45 min；
• 或者室温很高，接近 30℃，但你仍按“室温孵育”处理。

3. 处理建议

（1）先减小上样量 / 提高稀释倍数做预实验

• 建议拿少量样本做2–3 组稀释梯度：
• 当前倍数 D；
• 2D；
• 4D；
• 观察抑制率随稀释倍数的变化，找到落在 10–90% 区间的那一档。

（2）严格按说明书控制孵育时间 / 温度

• 开始孵育时记时间 → 到点直接进酶标仪读；
• 如果室温过高，建议按说明书改为 37℃ 恒温孵育，并保持时间一致；
• 避免 “第一行 30 min、最后一行 40 min” 这种隐形时间差。

（3）保留一部分高稀释倍数样本做“备用”

• 如果你怀疑某组 SOD 活性特别高，可以给这组额外设计“高倍稀释孔”，

  以免整板都贴顶时无数据可用。

四、抑制率过低：是 SOD 真低，还是被你处理没了？

关键词：“SOD 抑制率 过低”、“SOD 实验 失败 没有活性”

1. 典型症状

• ΔA_sample 与 ΔA_blank 几乎一样，抑制率接近 0；
• 有时 ΔA_sample 还比 ΔA_blank 大，抑制率为负；
• 你预期模型会有明显变化，但结果几乎一条水平线。

2. 核心原因

原因 1：样本本身 SOD 活性很低 / 模型确实把酶活打掉了

• 例如晚期严重损伤模型、极端条件处理；
• 这时抑制率低不一定是坏事，而是“模型真狠”。

原因 2：前处理不当导致 SOD 失活

• 匀浆 / 超声时不在冰上，温度一路飙；
• 多次冻融，样本在 −20℃ / 冰箱门口进进出出；
• 裂解液配制、pH、不加抗蛋白酶等诸多因素。

原因 3：稀释过头 / 试剂配错

• 低活性样本却参照高活性组织的稀释倍数；
• 工作液 / XO 漏加，或关键组分加错孔。

3. 处理建议

（1）在排除操作错误前，不要急着怪模型

先排除几件小事：

• 看一眼排板记录：该加 XO 的孔是否都加了？
• Blank / Blank Control 的 ΔA 是否正常？
• 公式、稀释倍数是否正确带入？

（2）优化样本前处理：冰、时间、冻存管理

• 匀浆 / 超声全程冰浴，尽量缩短操作时间；
• 减少冻融次数，一次取上清分装若干小管；
• 无法当天检测的样本，建议 −80℃ 直冻，避免在 4℃ 长时间放置。

（3）对低活性样本，降低稀释倍数

• 尤其是严重损伤、终末期模型，

  建议初次预实验就把稀释倍数放得相对“小气”一点，

  先确保抑制率能进 10–90% 区间。

五、背景大、重复性差：通常是“操作链条”在拉跨

关键词：“SOD 背景 大”、“SOD 实验 重复性 差”

1. 典型症状

• Sample Control A 值很高，与 Sample 孔差异不大；
• 同一组内个体间差异异常巨大；
• 复孔之间差距明显。

2. 核心原因

原因 1：样本本底太“脏”

• 严重溶血、脂血、色素多（部分植物 / 脏器）；
• 组织匀浆不清亮，悬浮颗粒多。

原因 2：工作液配制 / 混匀问题

• 工作液分批配（前半板和后半板不是同一锅）；
• 关键组分（如 WST-8、Enhancer、黄嘌呤）回温不充分、没涡旋均匀。

原因 3：排板 & 加样节奏问题

• 多通道枪使用不熟练，不同列开始计时点不同；
• 某些样本用了不同批次的试剂盒或不同配制时间的工作液。

3. 处理建议

（1）充分利用 Sample Control，把本底扣干净

• 对颜色深、浑浊度高的样本，必须保留 Sample Control；
• 计算 ΔA 时务必使用：
• ΔA_sample = A_sample − A_sample control

（2）匀浆 & 离心后严格“取中层”

• 去掉明显脂层、沉淀层，只取中间清亮的液体；
• 必要时多一次离心或简单过滤。

（3）工作液“一锅到底”，使用前充分混匀

• 同一块板的工作液尽量一次性配好，避免“前半板旧、后半板新”；
• 易分层组分（WST-8、黄嘌呤）使用前要充分涡旋混匀。

（4）固定加样节奏 & 使用多通道移液器

• 建议：先给所有孔加样本，再统一加工作液，再统一加 XO；
• 多通道枪从左到右“一扫”，整板计时才好统一。

六、计算错误：肉眼最难发现，但最常见

很多“实验失败”最后排查下来，其实是计算环节翻车：

• 忘记乘稀释倍数；
• 混淆匀浆总体积和上板体积；
• 只算 U/mL，却在文章里写成 U/g 或 U/mgprot。

如果你在用CheKine™ SOD kit（KTB1030），

强烈建议直接用你们专门配套的在线计算器：

CheKine™ KTB1030 专用 SOD 活性计算器