双荧光素酶报告基因检测试剂盒

自备耗材

• 细胞培养板、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水，PBS
• 低温离心机、96 孔全黑酶标板或全白酶标板
• 发光检测仪或多功能酶标仪

试剂准备

Lysis Buffer：临用前配制，内含不溶物，摇匀后使用，用去离子水将 Lysis Buffer (5×) 稀释 5倍得到 Lysis Buffer，-20℃保存。

Firefly Luciferase Solution：临用前配制，用 Firefly Luciferase Assay Buffer溶解 Firefly Luciferase Substrate，然后将其全部加入 Firefly Luciferase Assay Buffer瓶中，充分混匀后按使用需求分装，并避光保存于-80℃。

注意：Firefly Luciferase Solution 不能反复冻融，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格，-20℃避光保存，推荐 3个月内使用，-80℃避光保存，12个月内有效。

Renilla Luciferase Solution：临用前配制，根据实际使用量，以 50:1的比例将适量的 Renilla Luciferase Assay Buffer和 Renilla Luciferase Substrate (50×) 混匀。

注意：Renilla Luciferase Solution需现配，Renilla Luciferase Substrate (50×) 溶解于无水乙醇中，使用前需瞬时离心至管底，小心量取管内溶液体积，如发现液体体积有明显减少，请加入无水乙醇补足体积后保存。

实验步骤

1. 细胞裂解：

(1)细胞：

1. 在合适的孔板上培养细胞后进行转染并用适当的方法处理细胞。
2. 将培养基移除，加 PBS轻轻洗涤细胞 2次（贴壁细胞进行此操作，悬浮细胞可直接离心收集细胞），吸弃 PBS，按如下方案加入 Lysis Buffer。

注意：Lysis Buffer使用前摇匀，如荧光素酶的表达水平较低，可适当减少 Lysis Buffer用量，如 24孔板每孔加入 100 μL，6孔板每孔加入 200 μL。

3. 细胞置于摇床上震荡 5-10 min，充分裂解细胞。
4. 将细胞裂解产物 10,000 rpm离心 2 min，取上清用于检测。

(2)原生质体（仅供参考）：

1. 制备原生质体，并将相应的质粒转化原生质体。
2. 16-24 h后离心收集 2×10⁵原生质体，加入 200 μL的 Lysis Buffer。
3. 室温孵育 5-10 min，充分裂解原生质体。
4. 将原生质体裂解产物 10,000 rpm离心 2 min，取上清用于检测。

(3)植物叶片（仅供参考）：

1. 将含相应质粒的农杆菌注射植物叶片。
2. 注射后 2天取约 1 cm²的叶片加入 500 μL裂解液，匀浆器研磨后 10,000 rpm离心 2 min，取上清用于检测。

注意：细胞裂解后可立即检测荧光素酶活性，也可以冻存，需要时再进行检测，冻存样品需融解至室温再进行检测。

2. 小心吸取 20-100 µL细胞裂解上清（如果样品量足够，请加入 100 µL，如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量应保持一致）至检测管或 96孔全黑/全白酶标板中，将 100 µL平衡至室温的 Firefly Luciferase Solution加入检测管或酶标板中，迅速混匀后，立即于发光检测仪或多功能酶标仪中检测 Firefly Luciferase报告基因活性。
3. 在以上反应液中加入 100 µL 新鲜配制的 Renilla Luciferase Solution，迅速混匀后立即于发光检测仪或多功能酶标仪中检测 Renilla Luciferase报告基因活性。

注意事项

1. 由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行检测。较高的温度会导致信号强度增加，但信号稳定性较低，因此建议操作环境温度不超过 25℃。
2. 高活性的荧光素酶能够更快速地催化底物发光，产生大量的光信号。然而，这种快速反应往往会导致发光信号的半衰期缩短。
3. 为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，每个样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入 Firefly Luciferase Solution。
4. 检测时需使用全黑色或白色的 96孔板，防止相邻孔的干扰。
5. 萤火虫荧光素酶催化的生物发光的最强波长为 560 nm，海肾荧光素酶催化的生物发光的最强波长为 480 nm。
6. Renilla Luciferase Substrate易挥发，注意密封保存。

FAQ