Caspase-9 活性分析试剂盒(比色法)

Name: Caspase-9 活性分析试剂盒(比色法)
Brand: Abbkine
SKU: KTA3026
Price: 489 CNY
Availability: InStock

Caspase-9 Assay Kit (Colorimetric)

产品货号

KTA3026

产品特点：

简单、优化的实验流程，仅需裂解-孵育-读板三步即可完成检测

操作方便快捷，兼容常规 96 孔板，适合高通量筛选

可灵敏捕捉细胞凋亡早期/中期 Caspase-9 的活化信号

选择规格

20 T

¥489

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50 T

¥998

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100 T

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活动截止时间：2024年1月31日

产品概述

亚科因生物研发的Caspase-9 活性分析试剂盒（比色法） (Caspase-9 Assay Kit, Colorimetric) 是一套基于底物 Ac-LEHD-pNA 的比色体系，可在 96 孔板内快速、直观地检测细胞裂解液中 Caspase-9 的酶活性，为研究细胞凋亡早期/中期事件提供可靠工具。

背景知识

Caspase 全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase)，是一类在细胞凋亡与炎症反应中发挥关键作用的蛋白酶家族。在人类已鉴定的 11 种 Caspase 中，Caspase-9 属于 Caspase-2 亚族，是线粒体凋亡通路的核心启动子。当细胞受到凋亡刺激后，细胞色素 c 从线粒体释放并与 Apaf-1 形成凋亡体 (apoptosome)，进而招募并激活 Caspase-9；活化的 Caspase-9 进一步剪切并激活下游执行型 Caspase（如 Caspase-3、6、7），从而放大凋亡信号。本试剂盒利用 Caspase-9 特异性底物 Ac-LEHD-pNA，被酶切后释放游离的 pNA，其在 405 nm 处具有强吸收峰，吸光度变化与 Caspase-9 活性成正比，因此可通过比色法快速定量分析。

应用领域

本试剂盒适用于细胞水平的凋亡机制研究，可广泛应用于药物筛选、肿瘤生物学、神经退行性疾病模型、免疫调节及细胞治疗质量控制等场景，帮助科研人员快速评估样本中 Caspase-9 的活性变化。

产品参数

中文名称	Caspase-9 活性分析试剂盒(比色法)
英文名称	Caspase-9 Assay Kit (Colorimetric)
产品货号	KTA3026
检测类型	比色法
试剂盒组分	• Cell 裂解缓冲液 • 反应缓冲液 (2×) • Ac-LEHD-pNA (4mM) • pNA(10mM) • DTT (100×)
保存建议	请参阅说明书中各个组件的存储条件，自发货之日起，按照推荐的保存条件，有效期为12个月。
运输条件	冰袋运输（蓝冰）
警告	本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。

使用说明

自备耗材

酶标仪（能测 405 nm处的吸光度）
96孔板
低温离心机、制冰机
可调节式移液枪及枪头
去离子水、磷酸盐缓冲液(PBS)
匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

组分	规格	储存条件
Cell Lysis Buffer	5 mL (20 T) 10 mL (50 T) 20 mL (100 T)	4℃
Reaction Buffer (2×)	10 mL (20 T) 20 mL (50 T) 40 mL (100 T)	4℃
Ac-LEHD-pNA (4 mM)	100 µL (20 T) 250 µL (50 T) 500 µL (100 T)	-20℃, 避光保存
pNA (10 mM)	100 µL (20 T) 250 µL (50 T) 500 µL (100 T)	-20℃, 避光保存
DTT (100×)	150 µL (20 T) 400 µL (50 T) 750 µL (100 T)	-20℃

试剂准备

Working Cell Lysis Buffer: 使用前，立即加入 DTT（每 1 mL Cell Lysis Buffer加 10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。
Reaction Buffer (2×): 使用前，用去离子水稀释到 Reaction Buffer (1×)，再加入 DTT（每 1 mL Reaction Buffer (1×)加 10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。
Ac-LEHD-pNA (4 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
pNA (10 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
DTT (100×): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。

Standard设置

按下表所示，用 Reaction Buffer (1×，含 DTT)将标准品 pNA (10 mM) 稀释为 200、100、50、25、12.5、0 µM的标准溶液。

序号	标准品体积	Reaction Buffer (1×，含 DTT) (µL)	标准品浓度（μM）
Std.1	6 µL pNA (10 mM)	294	200
Std.2	150 µL of Std.1 (200 μmol/mL)	150	100
Std.3	150 µL of Std.2 (100 μmol/mL)	150	50
Std.4	150 µL of Std.3 (50 μmol/mL)	150	25
Std.5	150 µL of Std.4 (25 μmol/mL)	150	12.5
Std.6	0	150	0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：我们建议使用新鲜样品。或按照"样本制备"将样品保存在-80℃。使用前，在冰上解冻，这可能会影响样品的稳定性，并且读数可能会低于预期。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，它可能会干扰测定。

通过所需方法诱导细胞凋亡。同时，建议对每个 Caspase 9比色测定做不进行诱导的对照培养。
对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化收集细胞。600 g，4℃离心 5 min，小心吸去上清液。用 1 mL PBS洗涤细胞 2次。离心后，去除上清液。在 50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬 1-5×10⁶个细胞。
对于悬浮细胞，600 g，4℃离心 5 min，小心吸去上清液。用 1 mL PBS洗涤细胞 2次。离心后，去除上清液。在 50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬 1-5×10⁶个细胞。
对于动物组织，将 5-20 mg组织切成小块，用 PBS清洗组织，加入 0.1 mL Working Cell Lysis Buffer，冰浴匀浆。
裂解物冰上孵育 15-20 min。
16,000 g，4℃离心 15 min，然后将上清液转移至新试管中，置冰上待测。
立即测定 caspase 9的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用 Bradford法测定蛋白浓度。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪预热 30 min以上，调节波长到 405 nm。
操作表（下述操作在 96孔板中操作）：

项目	空白孔（μL）	测定孔（μL）	对照孔（μL）	标准孔（μL）
Working Reaction Buffer (1×，含 DTT)	100	50	55	0
Standard	0	0	0	100
上清	0	50	50	0
Ac-LEHD-pNA (4 mM)	5	5	0	0

混匀，37℃孵育 1-2 h，检测 405 nm处吸光值。空白孔记为 A 空，测定孔记为 A 测，对照孔记为 A 对。计算ΔA 测=A 测-A 空。仅组织样本需要设置对照孔，对于组织样本，ΔA 测=A 测-A 对。

立即检测 405 nm处吸光值，计算ΔA 标=A 标-AStd.6，AStd.6为不含pNA的标准孔的吸光值。

注意：1.空白孔和标准孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验；2.对于组织样本，样本本身有颜色，需要设置对照孔，细胞样本一般不需要设置对照孔；3.在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；4.发现颜色变化比较明显时即可测定 405 nm的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间至 4 h。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

按标准曲线计算
以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标为 y轴，绘制标准曲线 y=kx+b。将样本的ΔA 测带入方程得到 x值（μM）。
按酶活性增加百分比计算
Caspase-9活性增加百分比=(实验处理组 A 测定-A 空白)/(实验对照组 A 测定-A 空白)×100%
该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
按酶活计算
参考 Chemicon 公司的 caspase 酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在 37℃一个小时内可以剪切 1 nmol pNA 底物产生 1 nmol游离 pNA 的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的 caspase 9 酶活性。

Caspase 9 活性（U/mg prot）=x×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×10³=2.1×x÷Cpr÷T
V 反总：反应体系总体积，0.105 mL=1.05×10^-4L；V 样：加入的样本体积，0.05 mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10³：单位换算系数，1 μmol =10³ nmol。

注意：对于样品中 caspase 9酶活力特别高的情况，须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数 n。