应用指南 2026-11-06 阅读

谷草转氨酶（AST）检测在炎症性休克模型中的应用：AST、ALT、LDH 联合评价器官损伤的实验设计

在细胞因子休克、脓毒症等急性炎症模型中，动物存活率是评价干预效果的重要指标。但如果想进一步说明药物是否减轻了器官损伤，还需要结合血清生化指标。

AST、ALT 和 LDH 是这类研究中常见的检测指标。它们能够反映组织细胞损伤的情况，但各自的组织来源和解释范围并不相同。

2023 年，Biomedicine & Pharmacotherapy 发表了一项关于 Bcr-Abl 抑制剂 DCC-2036 的研究。论文主要探讨 DCC-2036 能否通过抑制坏死性凋亡（necroptosis）缓解骨关节炎，同时设置了 TNF-α 联合 IFN-γ 诱导的小鼠炎症性休克模型，检测血清 AST、ALT、LDH 和降钙素原（PCT）。

其中，AST 检测使用了 CheKine™ 谷草转氨酶（AST/GOT）活性检测试剂盒（货号 KTB1420）。

这项研究可以为类似实验提供参考：炎症性休克模型如何设置？AST、ALT 和 LDH 为什么要联合检测？如果准备开展血清 AST 检测，又需要提前考虑哪些问题？

一、研究中的炎症性休克模型是怎么设计的？

这篇论文主要研究 DCC-2036 对坏死性凋亡及骨关节炎的影响。

作者首先在大鼠软骨细胞和滑膜成纤维细胞中，研究 DCC-2036 对 TNF-α、Smac 模拟物和 z-VAD-FMK 联合诱导的坏死性凋亡的抑制作用。研究认为，DCC-2036 可以直接抑制 RIPK1 和 RIPK3 的激酶活性，从而抑制坏死性凋亡。

随后，作者通过大鼠 MIA 骨关节炎模型，进一步评价其治疗效果。

在此基础上，研究人员又增加了一个炎症性休克模型，考察 DCC-2036 的保护作用是否也能在其他炎症相关疾病模型中观察到。

该模型参考了 Karki 等人 2021 年发表于 Cell 的研究。原论文提到，部分严重 COVID-19 死亡患者在死亡前，血清 ALT、AST 和 LDH 呈进行性升高。TNF-α 联合 IFN-γ 诱导的动物模型，则可用于研究相关炎症反应及组织损伤。

1. 动物分组与处理

研究使用 6～8 周龄的 C57BL/6J 小鼠，随机分为两组，每组 10 只。

DCC-2036 组： 先给予 DCC-2036（1 mg/kg）预处理。
PBS 组： 给予 PBS 作为对照处理。

之后，两组小鼠均接受腹腔注射：

TNF-α：10 μg
IFN-γ：20 μg
溶剂：无菌 PBS

2. 观察与检测

研究设置了两个主要观察内容。

动物存活情况：

持续观察 24 h，每 30 min 记录一次存活情况。

血清生化指标：

在细胞因子注射后 5 h 取血，检测：

ALT（丙氨酸氨基转移酶）
AST（天门冬氨酸氨基转移酶）
LDH（乳酸脱氢酶）
PCT（降钙素原）

3. 实验结果

论文报告，与 PBS 组相比，DCC-2036 预处理组的小鼠存活率明显提高，血清 ALT、AST、LDH 和 PCT 水平均显著降低。

作者结合细胞实验、骨关节炎模型和炎症性休克模型的结果，认为 DCC-2036 对 RIPK1、RIPK3 的抑制作用，可能与其减轻炎症及组织损伤的效果有关。

不过，血清生化指标本身无法直接证明这种保护作用完全由某一条细胞死亡通路介导，相关机制还需要结合通路实验进行判断。

二、为什么要同时检测 AST、ALT 和 LDH？

AST、ALT 和 LDH 都是常见的胞内酶。当细胞受到损伤、细胞膜完整性受到破坏时，这些酶可能释放进入血液，使血清酶活性升高。

在急性炎症和组织损伤模型中，同时检测三项指标，可以从不同的组织分布特点出发，观察动物的整体损伤情况。

但在解释结果时，需要分清几个问题。

1. 血清酶升高，说明存在组织损伤的可能

坏死性凋亡的重要特征之一，是细胞膜完整性丧失，导致细胞内容物释放。

因此，在 TNF-α 联合 IFN-γ 诱导的炎症性休克模型中，AST、ALT 和 LDH 的变化，可以为组织细胞损伤提供生化证据。

如果药物处理后，这些指标的升高幅度减小，通常可以作为组织损伤减轻的支持性证据。

但血清酶活性并不等同于发生裂解的细胞数量。酶的组织来源、释放情况及体内清除等因素，都可能影响最终检测结果。

2. 血清酶无法直接判断细胞死亡方式

这是解释实验结果时容易混淆的一点。

AST、ALT 和 LDH 升高，可以提示细胞损伤及胞内成分释放，但不能仅凭这些结果判断细胞发生的是坏死性凋亡、焦亡，还是其他伴随细胞膜破坏的死亡过程。

论文在讨论中也提到，TNF-α 联合 IFN-γ 可能诱导 PANoptosis，即涉及凋亡、坏死性凋亡和焦亡的细胞死亡过程。

如果实验目的是证明某种药物通过抑制坏死性凋亡发挥保护作用，就需要结合 p-RIPK3、p-MLKL 等通路指标，以及其他机制实验。

血清 AST、ALT、LDH 更适合用于评价损伤变化，而不是单独作为细胞死亡机制的判断依据。

3. AST、ALT 和 LDH 的组织分布不同

虽然三项指标都与细胞损伤有关，但它们并不完全相同。

AST：分布范围较广。

AST 存在于肝脏、心肌、骨骼肌、肾脏等多种组织。血清 AST 升高可能与不同组织的损伤有关，不能单凭 AST 判断损伤来自哪个器官。

ALT：相对更偏向肝脏损伤评价。

ALT 在肝脏中的分布相对更集中，因此经常与 AST 联合用于评价肝细胞损伤。

不过，ALT 也不是绝对的肝脏特异性指标，仍需结合其他检测结果分析。

LDH：反映范围更广的细胞损伤。

LDH 广泛存在于多种组织和细胞中，包括红细胞。

在炎症性休克模型中，LDH 可以为整体组织损伤提供补充信息，但它缺乏器官特异性，且容易受到溶血等因素干扰。

三项指标联合检测，可以比单独检测其中一项获得更多生化信息。

需要注意的是，即使 AST、ALT 和 LDH 同时升高，也不能仅凭这三个指标就确定发生了多器官损伤。

如果研究重点是肝、肾、心脏等特定器官，还需要增加相应的器官功能指标和组织学检查。

4. PCT 提供的是另一类信息

论文除了检测三项血清酶，还检测了 PCT。

PCT 与 AST、ALT、LDH 的检测目的不同。前三项主要提供组织细胞损伤方面的信息，PCT 则为全身炎症状态提供补充参考。

但 PCT 受多种因素影响，不能单独用来量化炎症严重程度，也不能直接证明细胞死亡机制。

将这些指标与动物存活率、组织学及通路实验结合，才能更全面地解释药物的保护效果。

三、做类似实验时，血清 AST 检测需要注意什么？

如果准备参考这篇论文开展炎症性休克模型，除了动物分组和攻毒方案，血清样本的采集、检测范围以及试剂用量也需要提前规划。

以 CheKine™ 谷草转氨酶（AST/GOT）活性检测试剂盒（赖氏法，KTB1420）为例，可以重点考虑以下几个问题。

1. 取样时间点怎么确定？

这篇论文选择在细胞因子注射后 5 h 取血。

这个时间点来自作者的实验设计，并不意味着所有炎症性休克模型都适合在 5 h 检测 AST。

急性炎症模型中，血清酶活性可能随时间快速变化。动物品系、攻毒剂量和模型严重程度不同，指标变化的时间也可能不同。

如果是首次建立模型，建议先安排小规模预实验，在几个不同时间点采样，观察 AST、ALT 和 LDH 的变化，再确定正式实验的取样时间。

2. 存活观察与取血是否使用同一批动物？

论文记录了 24 h 内的小鼠存活情况，同时在注射细胞因子后 5 h 取血。

但方法部分没有明确说明，采血动物是否与存活观察动物完全相同，也没有详细交代采血方式。

自己设计实验时，应提前明确这两部分的动物如何安排。

如果采用终末采血，例如麻醉后摘眼球或心脏采血，采血后动物就不能继续用于 24 h 存活观察。

这种情况下，需要单独规划用于血清检测的动物数量。

采血方式、麻醉方法和动物使用数量，也必须符合所在机构的动物伦理审批要求。

3. 是否需要增加正常对照组？

论文方法中设置了 DCC-2036 预处理组和 PBS 对照组，每组 10 只。

两组均接受 TNF-α 联合 IFN-γ 处理，主要比较药物预处理对动物存活及血清指标的影响。

如果自己的研究还希望明确证明，攻毒后血清 AST、ALT 和 LDH 相对于正常水平发生了怎样的变化，就需要考虑增加未攻毒的基线对照组。

因此，是否设置正常对照，应根据实验目的决定。

4. 20 个血清样本需要多少检测孔？

以论文中每组 10 只、两组共 20 只动物为例，假设 20 个样本都需要检测 AST。

KTB1420 的检测需要为每个样本设置：

1 个测定孔
1 个对照孔

每个样本一次测定占用 2 孔。

如果采用单孔测定，另外设置 5 个标准曲线孔，则总孔数为：

5 + 20 × 2 = 45 孔

如果每个样本进行两次技术重复，样本对应的测定孔和对照孔也分别重复，则需要：

5 + 20 × 4 = 85 孔

两种方案均可以安排在一块 96 孔板内。

KTB1420 的 96 T 规格对应 48 个样本的常规检测用量。按上述 20 个样本进行技术复孔计算，理论上也在该规格的检测容量内。

实际安排时，还需要结合标准曲线设置、预实验、样本稀释和可能的重测情况，核算试剂总量。

5. 每个样本需要多少血清？

KTB1420 每个样本一次测定需要 10 μL 血清：

测定孔：5 μL
对照孔：5 μL

如果样本需要稀释后重新检测，还要预留相应的样本量。

炎症性休克模型通常不只检测 AST。这篇论文还检测了 ALT、LDH 和 PCT。

因此，采血前应分别核算四项检测所需的样本体积，再与单只小鼠预计能够获得的血清量进行比较。

不要只按照 AST 的用量安排采血，以免其他指标检测时出现样本不足。

6. 为什么要特别注意溶血？

红细胞内含有 AST 和 LDH。

如果采血或血清分离过程中发生溶血，红细胞内的酶释放出来，就可能使 AST、LDH 的检测结果偏高。

ALT 在红细胞中的含量相对较低，受溶血影响通常小于 AST 和 LDH，但也不能完全忽略样本质量的影响。

建议在实验过程中：

尽量避免采血和样本处理造成溶血。
血清分离后检查样本外观。
对明显发红的血清样本做好记录。
分析结果时，谨慎解释存在明显溶血的样本。

这些属于血清酶活性检测的通用注意事项，并非 KTB1420 独有的问题。

如果计划使用血浆样本，抗凝剂的选择需要提前确认。可咨询产品技术支持：400-6800-830。

7. 炎症性休克样本是否需要稀释？

这类模型尤其需要提前考虑检测范围。

KTB1420 直测血清的范围上限约为 72 U/L，对应 y 值 150。

炎症性休克模型可能出现较明显的血清酶活性升高。如果样本超出试剂盒的适用范围，就需要先进行适当稀释，再重新检测。

不建议所有样本直接采用同一个未经验证的稀释倍数。

正式实验前，可以从 PBS 组和药物处理组中选择几个具有代表性的样本，分别设置不同稀释梯度，观察检测结果是否落在适用范围内。

确定稀释方案后，再安排整批样本检测。

按照 KTB1420 的方案，样本可使用 1×PBS（pH 7.4）稀释。

每个样本的稀释倍数都应单独记录，并在最终酶活性计算中正确带入。

整板加样、孵育及结果计算的具体操作，可参考另一篇《谷草转氨酶（AST）活性检测实验方案：血清、组织与细胞样本的操作流程》。

8. 统计分析时，注意区分动物重复和技术重复

论文采用 Student's t 检验和单因素方差分析进行组间比较。

在动物实验中，如果每组有 10 只小鼠，那么每组的独立生物学重复单位是 10 只动物。

同一份血清样本重复加样两次，属于技术重复，主要用于评价检测过程中的重复性，不能把这两个检测孔当作两只独立动物。

两组比较可以考虑 t 检验，三组及以上可以考虑方差分析，但具体方法还应结合数据分布、方差情况和实验设计确定。

统计方法最好在正式实验开始前确定，避免结果出来后才临时选择。

四、不同研究目的，应该怎样搭配检测指标？

从这篇论文的实验设计来看，不同指标解决的问题并不相同。

研究问题	对应指标	主要作用
动物能否存活	24 h 存活曲线	评价动物整体结局
组织细胞损伤是否减轻	血清 AST、ALT、LDH	提供组织损伤的生化证据；对应 KTB1420、KTB1410、KTB1110
全身炎症状态如何变化	血清 PCT	提供炎症相关的补充信息
是否涉及坏死性凋亡通路	p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL	结合通路实验分析细胞死亡机制

其中，p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL 等通路指标，是论文在软骨细胞及组织相关实验中检测的内容，并不是通过血清 AST、ALT、LDH 检测获得的。

在实际研究中，如果只关注药物能否减轻急性组织损伤，存活曲线配合多项血清损伤指标，可以提供不同层面的证据。

如果还要进一步解释药物作用于哪条细胞死亡通路，就需要增加相应的分子机制实验。

五、小结

这篇研究虽然以骨关节炎为主要研究方向，但其中的 TNF-α 联合 IFN-γ 炎症性休克模型，对于开展急性炎症和组织损伤研究的实验人员，也有一定参考价值。

它将 24 h 存活观察与 5 h 血清生化指标检测结合，从动物整体结局和组织损伤两个方面评价药物干预效果。

其中，AST、ALT 和 LDH 联合检测，可以提供比单项血清酶更丰富的损伤相关信息，但这三项指标缺乏足够的器官特异性，也不能直接判断细胞死亡方式。

实际设计实验时，还应重点关注取样时间点、动物分组、采血方式、溶血干扰、样本稀释以及技术重复与生物学重复的区别。

对于血清 AST 活性检测，可以使用 CheKine™ 谷草转氨酶（AST/GOT）活性检测试剂盒（赖氏法，货号 KTB1420），并根据研究目的与 ALT活性检测试剂盒（KTB1410）、LDH检测试剂盒（KTB1110）联合使用。

实验结果应结合存活情况、其他生化指标、组织学和分子机制证据共同分析，不宜仅凭血清酶活性变化推断具体损伤器官或细胞死亡通路。

参考文献

Piao L, Wu D, Rui C, Yang Y, Liu S, Liu J, Jin Z, Zhang H, Feng X, Bai L. The Bcr-Abl inhibitor DCC-2036 inhibits necroptosis and ameliorates osteoarthritis by targeting RIPK1 and RIPK3 kinases. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2023, 161: 114528.

具体实验设计及研究数据请以论文原文为准。