谷草转氨酶（AST）活性检测原理：赖氏法的卡门氏单位是怎么来的？

第一次用赖氏法测谷草转氨酶（AST/GOT）活性，可能会遇到几个疑问：

测的是 AST，为什么标准品用的是丙酮酸钠？结果为什么要用“卡门氏单位”表示，还要乘以 0.482？标准曲线为什么不是直线？

这些问题都与赖氏法的检测原理和单位换算有关。弄清楚反应过程、标准品的作用以及卡门氏单位的定义，再看试剂盒的计算公式，就容易理解了。

一、先看反应：AST 做了什么，颜色从哪里来？

AST 催化 L-天门冬氨酸与 α-酮戊二酸之间的可逆转氨基反应，生成 L-谷氨酸和草酰乙酸：

L-天门冬氨酸 + α-酮戊二酸 ⇌ 草酰乙酸 + L-谷氨酸

草酰乙酸在反应过程中会自行脱羧，生成丙酮酸：

草酰乙酸 → 丙酮酸 + CO₂

生成的丙酮酸再与 2,4-二硝基苯肼反应，形成 2,4-二硝基苯腙，在碱性条件下呈棕红色，于 505 nm 处测定吸光度。

整个酶促反应在 37℃、pH 7.4 条件下进行。

检测原理是：在相同反应时间内，AST 活性越高，生成的草酰乙酸越多，随后转化形成的丙酮酸也越多，显色通常越深。

因此，扣除空白和对照背景后，505 nm 处吸光度的变化，可以用来反映反应期间丙酮酸的生成情况。

这里还可以对比一下 AST 和 ALT。

ALT 以丙氨酸为底物，直接生成丙酮酸；AST 的直接产物则是草酰乙酸，需要经过脱羧形成丙酮酸，才能进入后续的显色反应。

这也是两种转氨酶虽然都可以使用赖氏法检测，但前面的酶促反应过程并不完全相同的原因。

二、标准品为什么用丙酮酸钠？

既然最终检测的是丙酮酸参与显色后产生的吸光度，就可以使用已知浓度的丙酮酸钠建立标准曲线。

标准品的作用，是建立丙酮酸量与吸光度之间的对应关系。

以 CheKine™ AST活性检测试剂盒（赖氏法，KTB1420）为例，标准溶液为 2 µmol/mL 的丙酮酸钠。

四个标准孔分别加入 2、4、6、8 µL 标准溶液，对应的丙酮酸量依次为 4、8、12、16 nmol，另外设置一个不含标准品的空白孔。

不过，试剂盒最后报告的并不是丙酮酸生成量，而是 AST 活性。

两者有区别。

丙酮酸生成量表示一定时间内积累了多少产物；酶活性则反映酶催化反应的速率。

因此，还需要把标准品的显色结果与酶活性单位对应起来。

KTB1420 为各标准孔指定了相应的卡门氏单位：

这组对应关系来自经典赖氏法（Reitman 与 Frankel，1957）的方法经验标定，并不是单纯根据丙酮酸的物质的量，通过一个理论公式计算得到的。

标准曲线的作用，就是把实际测得的吸光度换算成对应的卡门氏单位。

为什么还要设置空白孔和对照孔？

因为显色反应并不只针对酶促生成的丙酮酸。

2,4-二硝基苯肼可以与多种酮酸反应，AST 反应底物中的 α-酮戊二酸也可能参与显色。

为了减少这些背景信号对结果的影响，需要进行空白和对照扣除。

标准孔的计算：

ΔA标准 = A标准 − A空白

空白孔使用相同的试剂体系，但不加入标准品，用于扣除标准体系的背景吸光度。

样本孔的计算：

ΔA测定 = A测定 − A对照

对照孔中的样本是在第一阶段 30 min 孵育结束后才加入的，没有经历这段酶促反应。

将测定孔和对照孔的吸光度相减，主要就是为了得到这 30 min 内酶促反应产生的净显色信号。

这也解释了为什么每个样本需要设置测定孔和对照孔。

三、卡门氏单位是什么？为什么还要乘以 0.482？

赖氏法的检测结果通常先通过标准曲线得到卡门氏单位，再根据试剂盒公式换算成 U/L 等活性单位。

其中的 0.482，来自卡门氏单位与国际单位之间的换算关系。

1. 卡门氏单位如何定义？

卡门氏单位建立在 340 nm 的 NADH 检测体系上。

在 25℃、反应液总体积 3 mL、样本体积 1 mL、光径 1 cm 的条件下，如果反应 1 min 使 NADH 氧化为 NAD⁺，并使 340 nm 处吸光度下降 0.001，就定义为 1 个卡门氏单位。

国际单位则按酶催化反应的物质的量来表示。

按照这里采用的单位口径，1 U/L 表示每升样本在 1 min 内催化消耗 1 µmol NADH。

两种表示方法看起来不同，但可以通过 NADH 的摩尔吸光系数换算。

2. 0.482 是怎么算出来的？

NADH 在 340 nm 处的摩尔吸光系数约为：

6.22 mM⁻¹·cm⁻¹

当光径为 1 cm、吸光度下降 0.001 时，根据朗伯–比尔定律，NADH 浓度的下降量为：

0.001 ÷ 6.22 ≈ 1.61 × 10⁻⁴ mM

也就是约 0.161 µM。

反应液总体积为 3 mL，所以 1 min 内消耗的 NADH 约为：

0.161 µM × 3 mL ≈ 0.482 nmol

这些 NADH 的消耗对应 1 mL 样本。

折算到每升样本，相当于每分钟消耗 0.482 µmol NADH。

因此：

1 卡门氏单位 = 0.482 U/L

这里的 0.482 是由吸光度变化量、NADH 摩尔吸光系数、反应液体积和样本体积共同决定的换算系数，并不是实验中另外拟合出来的经验系数。

温度没有直接出现在这一步数学换算中，但卡门氏单位的上述定义采用的是 25℃ 条件。

3. 公式里的 4.82×10⁻⁴ 又是怎么来的？

以组织样本为例。

通过标准曲线得到卡门氏单位 y 后，先换算出提取液的 AST 活性：

AST（U/L）= 0.482 × y

如果要进一步按组织质量表示，则需要考虑提取液体积和组织质量。

公式为：

AST（U/g）= 0.482 × y × V ÷ W

其中：

• y：标准曲线计算得到的卡门氏单位

• V：提取液体积，单位为 L

• W：组织质量，单位为 g

当加入的缓冲液体积为 1 mL，也就是 0.001 L 时：

0.482 × 0.001 = 4.82×10⁻⁴

因此，产品公式中的 4.82×10⁻⁴，就是在这一提取体积条件下得到的系数。

如果实际加入的缓冲液体积不同，计算时应使用对应的实际体积，并统一单位。

细胞样本按 U/10⁶ 个计算时，也是将总活性除以以 10⁶ 个为单位的细胞数量 N。

按蛋白浓度计算时，则用 U/L 除以蛋白浓度（g/L），得到 U/g prot。

4. 505 nm 测定为什么能得到卡门氏单位？

这里容易产生一个疑问：

卡门氏单位的定义来自 340 nm 的 NADH 体系，而赖氏法实际检测的却是 505 nm 的显色反应。这两个结果怎么联系起来？

联系它们的就是前面提到的标准曲线。

KTB1420 通过预先建立的经验标定关系，将 505 nm 处测得的吸光度与卡门氏单位对应起来。

因此，505 nm 是实际检测波长，卡门氏单位是标准曲线换算后的结果表达方式。

两者并不矛盾，只是承担着不同的作用。

四、标准曲线为什么不是直线？

观察 KTB1420 的标准数据，可以发现一个现象：

随着丙酮酸量增加，吸光度的变化大致接近线性，但对应的卡门氏单位增长得更快。

下面的吸光度数据，是根据产品提供的典型标准曲线反推得到的近似值：

y = 2175.3x² + 158.93x + 0.5902

实际实验中的吸光度可能与这些典型值不同。

从表中可以看出，丙酮酸量从 4 nmol 增加到 16 nmol，吸光度也大致按比例增加。

每 nmol 丙酮酸对应的 ΔA，从约 0.018 下降至约 0.016，变化幅度约为一成。

这说明，在这组典型数据中，显色过程表现出近似线性的关系。

但卡门氏单位的增长并不是这样。

丙酮酸量为 4 nmol 时，每 nmol 对应 6.0 个卡门氏单位；到了 16 nmol，每 nmol 已经对应 11.9 个卡门氏单位。

也就是说，随着活性升高，单位丙酮酸生成量所对应的卡门氏单位也在增加。

因此，这条曲线的弯曲，主要体现在丙酮酸生成量与卡门氏单位的换算关系上，而不是单纯由显色反应引起。

为什么会出现这种非线性关系？

可以从终点法和初速度法的区别来理解。

终点法测定的是固定反应时间内积累的产物；卡门氏单位的定义则与反应速率有关。

一种可能的酶动力学解释是：在较高酶活性条件下，固定反应时间内底物消耗得更多，累积产物量与初始反应速率之间不再保持简单的正比例关系。

这样一来，相同的产物生成量，在较高活性范围内就可能对应更高的卡门氏单位。

此外，显色试剂对不同酮酸的反应性存在差异，也可能影响显色关系。

需要区分的是，这些属于对非线性现象的可能解释，并不能据此认定 KTB1420 标准曲线弯曲的具体原因。

这组卡门氏单位对应值本身属于经验标定，实际计算仍应以产品规定的标准曲线和实验测得的数据为准。

五、理解这些原理，对实验有什么帮助？

1. 标准曲线不能简单按直线拟合

KTB1420 采用二次多项式标准曲线。

如果直接使用线性拟合，尤其在高活性范围，可能产生系统性偏差。

因此，应按照产品说明书要求进行曲线拟合，并在每次实验中同板制作标准曲线。

2. 不要随意外推标准曲线

KTB1420 的标准曲线覆盖 0～190 卡门氏单位。

按照文中所述的产品要求，如果样本计算得到的 y 值超过 150，应稀释后重新检测；如果低于 3，则需要增加样本量。

这些操作是为了使样本结果落在适合定量的范围内。

超出标准曲线范围后，曲线形状缺少对应标准数据的支持，直接外推可能影响结果可靠性。

3. 比较实验结果时，要先统一方法和单位

赖氏法通过标准曲线得到卡门氏单位，再使用 0.482 等系数进行换算。

但不同检测方法、不同反应温度下报告的 AST 活性，即使最终都使用 U/L，也不能简单认为数值可以直接互换。

尤其是在比较不同研究或不同试剂盒的数据时，需要关注检测原理、反应条件、单位定义和换算方法。

同一研究中尽量保持检测方法及结果表达方式一致，更有利于数据比较。

六、KTB1420 采用的就是这套检测体系

CheKine™ 天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶/AST/GOT）活性检测试剂盒（赖氏法，货号 KTB1420），采用上述检测原理。

酶促反应条件为 37℃、pH 7.4，检测波长为 505 nm，使用 2 µmol/mL 丙酮酸钠标准溶液，并要求每次实验制作标准曲线。

试剂盒适用于动物组织、细胞和血清（浆）样本。

根据样本类型及归一化方式，结果可以按血清体积、组织质量、细胞数量或蛋白浓度表达。

使用这类试剂盒时，理解标准曲线和单位换算的关系，有助于正确计算数据，也能减少不同检测方法之间因单位口径不同而产生的误解。

如果还需要比较不同 AST 检测方法的特点，可以阅读：

《谷草转氨酶（AST）活性检测试剂盒怎么选？赖氏法与速率法、样本与量程的选购要点》

本产品仅供科学研究使用，不用于临床诊断。具体操作条件、计算公式及适用范围以产品随附说明书为准。