谷草转氨酶（AST）检测在环境污染物肝损伤研究中的应用：壬基酚肝纤维化模型的实验设计解读

壬基酚（Nonylphenol，NP）是一类常见的环境内分泌干扰物，进入机体后可在肝脏中蓄积，并对肝脏造成损伤。

2025 年，Ecotoxicology and Environmental Safety 发表了一项关于壬基酚诱导肝纤维化的研究。研究人员分别建立细胞和小鼠模型，考察壬基酚如何影响肝星状细胞的线粒体自噬和脂滴代谢，并进一步促进肝纤维化。

在动物实验中，研究人员使用 CheKine™ 谷草转氨酶（AST/GOT）活性检测试剂盒（货号 KTB1420）和 ALT活性检测试剂盒（货号 KTB1410），检测小鼠血清中的 AST、ALT 活性。两项检测均采用 505 nm 波长读取吸光度，并通过标准曲线计算酶活性。

对于正在开展环境污染物肝毒性研究的实验人员，这篇论文有不少可以参考的地方。例如，如何设置污染物暴露剂量，怎样结合细胞和动物模型验证作用机制，以及为什么研究肝纤维化时还需要检测血清 AST、ALT。

本文结合这项研究，重点介绍实验设计、AST 检测的作用，以及开展类似实验时需要考虑的样本和检测安排。

一、从细胞到动物：壬基酚肝纤维化模型是怎么建立的？

研究人员关注的问题是：壬基酚在肝脏中蓄积后，究竟通过什么机制促进肝纤维化？

论文提出的机制涉及 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬。研究人员认为，壬基酚可能通过激活肝星状细胞（HSC）中的这一通路，促进脂滴降解，进而推动肝纤维化。

为了验证这一假设，实验分为细胞和动物两个部分。

1. 细胞实验：观察线粒体自噬与肝星状细胞活化的关系

细胞实验采用人肝星状细胞 LX-2，设置六个实验组：

• 对照组

• Parkin 抑制剂组

• NP 处理组（40 μM）

• Parkin 抑制剂 + NP 组

• 线粒体自噬抑制剂 Mdivi-1 组

• Mdivi-1 + NP 组

抑制剂预处理 2 h 后，再加入 NP 处理 24 h。

这样的分组可以比较单独暴露于 NP 和抑制相关通路后的细胞反应，从而判断 Parkin 和线粒体自噬是否参与 NP 诱导的变化。

检测指标包括三类：

纤维化相关指标： α-SMA、Collagen Ⅰ，用于观察肝星状细胞的活化及纤维化相关变化。

脂滴相关指标： Perilipin 5（Plin5），用于研究脂滴代谢变化。

线粒体自噬相关指标： Pink1、Parkin、Beclin1、LC3 Ⅱ，用于分析相关通路的变化。

需要注意的是，细胞实验所用抑制剂的特异性存在一定局限。论文在讨论中也提到了这一点，因此研究人员进一步采用 Parkin 基因敲除小鼠，从动物层面补充验证。

2. 动物实验：设置剂量梯度和 Parkin 基因敲除模型

动物实验采用野生型小鼠和 Parkin 敲除（KO）小鼠，共设置七组。

野生型小鼠分为五组：

• 对照组：玉米油

• NP 低剂量组：25 mg/kg/天

• NP 中剂量组：50 mg/kg/天

• NP 高剂量组：100 mg/kg/天

• CCl₄ 肝纤维化模型组：10% CCl₄，5 mL/kg，腹腔注射，每周三次

Parkin KO 小鼠分为两组：

• Parkin KO 对照组：玉米油

• Parkin KO + NP 组：100 mg/kg/天

NP 采用每天早晨灌胃的方式给药，连续处理 35 天。

末次灌胃后，小鼠禁食 24 h，麻醉后通过摘眼球方式采血，分离血清并保存于 -80℃，用于后续生化检测。

关于 NP 剂量，论文以其口服 LD50（1310 mg/kg）作为参考，讨论了亚慢性暴露剂量与 LD50 的关系，其中涉及 1/20～1/5 的剂量范围，1/20 约为 60 mg/kg。结合预实验结果，最终选择 50 mg/kg 为中剂量，25 mg/kg 和 100 mg/kg 分别作为低、高剂量。

这种设计既能观察不同 NP 暴露剂量下的肝损伤变化，也能比较 Parkin 缺失后，高剂量 NP 是否仍然产生相同程度的损伤。

3. 检测指标如何安排？

动物实验除了检测血清 ALT、AST，还设置了多项组织和分子指标。

• 肝指数： 通过肝脏湿重与体重之比，观察肝脏整体变化。

• 血清 ALT、AST： 评价肝损伤相关的生化变化。

• Masson 染色： 观察肝组织胶原沉积情况。

• 透射电镜： 观察线粒体、自噬体和脂滴数量及形态。

• WB、qPCR 和免疫荧光： 分析纤维化相关蛋白及线粒体自噬通路的变化。

论文结果显示，随着 NP 剂量增加，小鼠肝指数升高，血清 ALT、AST 活性也逐渐升高。

在 Parkin KO 小鼠中，这些变化有所减轻。

不过，Parkin KO + 高剂量 NP 组的 ALT、AST 仍显著高于对照组和 Parkin KO 组，说明 Parkin 缺失减轻了 NP 引起的损伤，却没有完全消除其影响。

作者在讨论 Plin5 和纤维化指标时也观察到了类似现象，认为 NP 诱导的肝纤维化可能还涉及 Parkin 以外的其他机制。

从实验安排来看，细胞实验主要研究分子机制，动物实验则同时观察肝损伤、组织纤维化和相关通路变化。AST、ALT 的检测正是动物实验中评价损伤程度的重要组成部分。

二、研究肝纤维化，为什么还要检测 AST？

既然论文主要研究的是肝纤维化和线粒体自噬，为什么还要测血清 AST、ALT？

原因在于，肝细胞损伤、肝纤维化和线粒体自噬虽然彼此相关，却是不同的生物学过程。单靠某一种检测指标，很难把这些变化全部解释清楚。

1. AST 升高反映细胞损伤，不能直接代表纤维化程度

AST 是参与氨基酸代谢的转氨酶，正常情况下主要分布在细胞内。

当肝细胞受到损伤时，细胞内的酶可能释放进入血液，使血清 AST 活性升高。

因此，在环境污染物肝毒性研究中，AST 常被用于观察暴露后是否出现细胞损伤相关的生化变化。

但肝纤维化涉及细胞外基质异常沉积，血清 AST 无法直接反映胶原沉积的程度。

在这项研究中：

• 血清 AST、ALT 用于观察肝损伤相关变化。

• Masson 染色用于观察胶原沉积。

• α-SMA、Collagen Ⅰ 用于评价纤维化相关变化和肝星状细胞活化。

如果实验发现 AST 升高，只能说明存在细胞损伤相关的异常，不能据此判断已经发生肝纤维化，更不能单凭 AST 数值评估纤维化严重程度。

2. AST 不是肝脏特异性指标，需要结合其他检测结果

AST 不只存在于肝脏，在心肌、骨骼肌和肾脏等组织中也有分布。

血清 AST 升高可能与不同组织的损伤有关，不能仅凭这个指标确定酶的来源。

这一点在全身性基因敲除动物模型中尤其需要注意。

这项研究采用的是全身 Parkin KO 小鼠，血清 AST 检测反映的是血液中的总酶活性，无法直接区分来自哪一种组织。

研究人员同时检测 ALT，并结合肝指数、肝组织病理学结果进行分析，可以为判断肝脏损伤提供更多依据。

因此，在类似研究中，AST 通常适合与 ALT 联合检测，而不是作为唯一的肝损伤指标。

3. 总 AST 活性不能直接说明线粒体是否受损

AST 在细胞内主要有胞质型和线粒体型两种形式。

由于本研究涉及线粒体自噬，实验人员可能会进一步关心：血清 AST 升高，是否说明线粒体损伤加重？

这里需要区分检测对象。

KTB1420 测定的是样本中的总 AST 活性，并不区分胞质型与线粒体型 AST。

因此，即使检测发现 AST 明显升高，也不能仅凭这一结果判断线粒体受损程度，更无法直接证明 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬发生了变化。

论文对线粒体相关变化的分析，主要依靠透射电镜观察，以及 Pink1、Parkin、Beclin1、LC3 Ⅱ 等指标。

血清 AST 检测与这些机制实验提供的是不同类型的信息。

4. 为什么细胞实验没有直接采用血清 AST 检测？

论文中的 LX-2 细胞实验，主要研究肝星状细胞活化、脂滴降解及相关分子机制。

血清 AST、ALT 则用于动物实验，观察污染物暴露后机体出现的生化变化。

两者的检测对象和研究目的不同，不能简单互相替代。

论文还观察到，Plin5 在细胞实验中的变化不显著，但在动物实验中出现了显著变化。这也说明，细胞模型与整体动物模型的结果不一定完全一致，需要结合多种证据分析。

三、开展类似研究，血清 AST 检测应该怎么规划？

对于准备使用 KTB1420 开展动物肝损伤研究的实验人员，试剂盒是否适用只是其中一个问题。

取样时间、样本数量、板位、血清用量和样本稀释倍数，都需要提前安排。否则即使动物实验顺利完成，也可能因为样本量不足或检测安排不合理，影响后续数据分析。

下面以这篇论文的七组动物实验为例说明。

1. 统一取样时间，减少实验条件带来的差异

这项研究连续给予 NP 35 天，末次灌胃后禁食 24 h，再采集血液。

这样的检测时间点主要反映连续暴露后的状态，并不是观察单次给药后短时间内的急性变化。

设计类似实验时，建议提前统一：

• 末次给药至采血的间隔时间

• 禁食时间

• 采血和血清分离条件

• 血清保存条件

不同处理组如果采用不同的取样时间或禁食条件，可能给 AST、ALT 的组间比较带来额外干扰。

2. 先计算样本数，再安排 96 孔板

论文每组使用 6 份血清，共七组。

按每组 6 个样本计算：

7 组 × 6 个样本 = 42 个血清样本。

KTB1420 每个样本检测时需要设置测定孔和对照孔，因此每个样本占用 2 孔。

如果每个样本只做一次检测：

• 42 个样本需要 84 孔。

• 标准曲线需要 5 孔。

• 合计需要 89 孔。

一块 96 孔板可以完成检测，96 T 规格（48 个样本）也能够满足这一方案。

如果准备进行复孔检测，就需要重新安排板位。

42 个样本做复孔时，可分成两块 96 孔板，每块检测 21 个样本，每个样本的测定孔和对照孔均设置复孔。

建议每块板分别安排七个实验组，每组各放 3 只动物的样本，并分别建立标准曲线。

这样，各实验组的样本都分布在两块板上，可以减少板间差异与实验分组相互混淆的风险。

3. 按单只动物计算血清消耗量

KTB1420 每个样本进行一次测定，需要使用 10 µL 血清：

• 测定孔：5 µL

• 对照孔：5 µL

如果设置复孔，或者需要对超出检测范围的样本进行稀释重测，血清消耗量也会随之增加。

这项研究还需要检测 ALT，因此应另外按照 KTB1410 的操作要求计算血清用量。

动物实验往往需要在同一份血清中检测多个生化指标。实验前最好逐项计算所需体积，再结合单只小鼠实际能够获得的血清量，安排样本分装。

4. 小鼠血清 AST 检测，为什么要特别注意稀释？

根据 KTB1420 的检测范围，血清直接测定的上限约为 72 U/L，对应标准曲线的 y 值为 150。

动物血清中的 AST 活性可能超出这一范围，因此在正式检测前，建议先通过预实验确定合适的稀释倍数。

可以从对照组和 NP 高剂量组中各选取具有代表性的样本，先进行测试。

如果检测值超出标准曲线范围，需要进一步稀释。

按照试剂盒要求，可使用 1×PBS（pH 7.4）进行稀释，并记录每个样本的稀释倍数。

正式检测时，应尽量让不同组样本的吸光度落在标准曲线适用范围内。

需要注意，最终计算结果时，必须将稀释倍数纳入计算，否则会低估样本的实际 AST 活性。

5. AST 结果的单位要写清楚

这篇论文 Fig. 3B 的 AST 图中，纵坐标没有标注单位，因此主要能够用于比较不同实验组之间的相对变化。

如果自己开展类似实验，建议在图表和方法部分明确注明单位及计算方式。

KTB1420 采用赖氏法检测 AST 活性，血清样本结果可由卡门氏单位乘以 0.482 换算，最终以 U/L 表示。

如果样本经过稀释，还需要乘以相应的稀释倍数。

注明这些信息，有助于其他研究人员理解检测结果，也方便后续比较和复现实验。

6. 统计方法要结合数据分布选择

论文的方法部分说明：

当数据符合正态分布且满足方差齐性要求时，使用方差分析；不符合条件时，采用 Kruskal–Wallis 检验。

在结果部分，AST 报告的是方差分析的 F 值，ALT 则报告 Kruskal–Wallis 检验的 H 值。

这意味着，即使是同一批动物、同一次血清检测获得的数据，也不一定采用完全相同的统计方法。

每组只有 6 份样本时，分布检验的统计效能有限。建议在实验设计阶段就考虑样本量、数据分布及后续分析方法，而不是获得全部数据后再临时决定。

7. 如果测的是肝组织 AST，实验安排有什么不同？

如果研究目的不仅是观察血清酶活性变化，还希望检测肝组织中的 AST 活性，也可以考虑肝组织匀浆样本。

按照 KTB1420 的样本处理建议，肝组织匀浆可考虑稀释 20～60 倍后进行检测。

具体前处理方法、检测步骤及计算方式，可参考《谷草转氨酶（AST）活性检测实验方案：血清、组织与细胞样本的操作流程》。

血清 AST 和肝组织 AST 的检测对象不同，结果也不一定呈现相同的变化方向。分析时应分别结合各自的样本类型和实验目的进行解释。

四、AST 与哪些指标联合检测，更适合肝毒性研究？

在环境污染物肝损伤实验中，AST、ALT 通常是常用的生化指标，但如果研究还涉及肝纤维化和线粒体自噬，就需要增加相应的组织学和分子生物学检测。

这项壬基酚研究的指标安排可以作为参考。

其中，血清 AST、ALT 可以使用 KTB1420 和 KTB1410 进行联合检测。

Masson 染色、纤维化标志物及线粒体自噬相关指标，则需要根据实验目的分别安排。

对于一般的污染物肝毒性研究，如果主要关注肝细胞损伤，AST、ALT 联合肝组织病理学检测通常可以提供较为直接的证据。

如果进一步研究污染物诱导肝纤维化的分子机制，就需要增加纤维化标志物、细胞功能及相关信号通路的检测。

因此，检测项目不必机械照搬论文，而应根据研究假设和需要验证的机制选择。

五、小结

这项壬基酚研究结合了剂量梯度、细胞通路抑制和 Parkin 基因敲除动物模型，并使用 CCl₄ 肝纤维化模型作为参照。

对于准备开展类似环境污染物肝毒性研究的实验人员，有三个方面值得参考。

首先，污染物暴露实验可以设置不同剂量，观察损伤是否随剂量变化；如果还需要研究作用机制，可以进一步结合抑制剂或基因敲除模型。

其次，血清 AST、ALT 适合用于观察细胞损伤相关的生化变化，但不能代替肝纤维化及线粒体自噬检测。研究涉及不同生物学过程时，需要分别安排相应指标。

最后，动物血清检测应提前确定取样条件、血清用量、板位及稀释方案。特别是高剂量污染物暴露组，AST 活性可能超出试剂盒直接测定范围，正式实验前最好先进行小规模预实验。

本文涉及的 CheKine™ 天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶/AST/GOT）活性检测试剂盒（赖氏法，货号 KTB1420） 适用于动物组织、细胞及血清（浆）等样本，采用微量法检测，血清样本每孔用量为 5 µL，可与 ALT 活性检测试剂盒 KTB1410 配合使用。

对于需要同时观察肝损伤生化指标和组织学变化的实验，这类联合检测可以为实验结果提供补充依据。

参考文献

Li F, Yu J, Wang S, Yang X, Yao H, Pan K, Yu H, Wang F, Xu J. Mechanistic study on nonylphenol-induced liver fibrosis via Pink1/Parkin-mediated mitophagy and lipid droplet degradation in hepatic stellate cells. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2025, 305: 119206.

具体实验设计及数据请以原始论文为准。

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