应用指南 2026-11-04 阅读

谷草转氨酶（AST）活性检测实验方案：血清、组织与细胞样本的操作流程

做谷草转氨酶（AST/GOT）活性检测，除了按说明书加样、孵育和读数，还有几件事容易影响实验进度：样本该怎么处理？肝脏样本要稀释多少倍？一块板能测多少个样本？试剂量够不够？最后计算时，稀释倍数又该怎么处理？

本文以 CheKine™ 天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶/AST/GOT）活性检测试剂盒（赖氏法，货号 KTB1420）为例，按照实际实验顺序，介绍血清、组织和细胞样本的制备、加样、孵育、读数及结果计算。

其中涉及的孔数和试剂用量，也给出了具体计算方法，方便实验前安排样本和试剂。

一、实验开始前，先确定三件事

正式操作之前，建议先确认样本类型、稀释倍数和结果表达方式。这三件事会直接影响后续的样本制备与计算。

1. 明确样本类型

不同样本的前处理方式不同：

血清（浆）：可以直接检测。
动物组织：需要先匀浆，再离心取上清。
细胞：需要超声破碎，再离心取上清。

样本处理方式不同，后续结果归一化所用的数据也不一样。

2. 提前考虑样本是否需要稀释

肝脏组织中的 AST 含量较高，建议将提取液稀释 20～60 倍后检测。

血清和其他组织没有统一适用的稀释倍数。尤其是损伤模型中的样本，AST 活性可能明显升高，直接检测有超出量程的可能。

建议正式检测前先做一次预实验。

可以从不同实验组中挑选 2～3 个预计差异较大的样本，例如对照组和模型组各选一个，完成加样、孵育和读数，再根据计算出的 y 值判断是否需要稀释，以及采用多大的稀释倍数。

这样可以减少正式实验时因超出检测范围而重新测定的情况。

3. 确定最终结果如何表达

AST 活性可以采用不同的归一化方式：

血清（浆）：按样本体积表达。
组织：按组织质量或蛋白含量表达。
细胞：按细胞数量或蛋白含量表达。

如果准备按照蛋白含量计算 AST 活性，需要在制备样本时留出一部分提取液，用于测定蛋白浓度。蛋白定量可以使用配套的 BCA 法蛋白质定量试剂盒 KTD3001。

组织质量、细胞数量也要在样本制备时记录。等到实验结束再补这些数据，往往就来不及了。

二、需要准备哪些仪器和试剂？

1. 实验前的准备

酶标仪：提前预热 30 min 以上，检测波长设为 505 nm。
恒温设备：提前开启，温度设为 37℃。
试剂：从 4℃ 取出，使用前平衡至室温。

2. 试剂盒组分

KTB1420 试剂盒包括 5 个组分：

Reagent Ⅰ
Reagent Ⅱ
Reagent Ⅲ
Reagent Ⅳ
Standard：2 µmol/mL 丙酮酸钠标准溶液

所有组分均为即用型试剂，不需要额外配制，保存温度为 4℃。其中，Reagent Ⅱ 需要避光保存。

各组分在规格用量之外额外提供了 10% 的试剂量，可用于标准曲线制作或预实验。

3. 样本制备和检测设备

样本制备需要：

组织匀浆器或研磨仪
超声破碎仪
低温离心机
制冰机
1×PBS（pH 7.4）

检测需要：

透明 96 孔板
适用于小体积加样的单道移液器
多通道移液器（样本较多时使用）

样本和标准品的加样体积较小，建议使用量程合适的移液器。试剂加样量较大时，可以使用多通道移液器提高操作效率。

4. 实验安全

实验过程中应穿实验服、佩戴口罩和手套，建议同时佩戴护目镜，并根据试剂和样本性质，在通风橱或生物安全柜内完成相应操作。

尤其要注意 Reagent Ⅲ 的加样。每孔需要加入 200 µL，整板实验的试剂用量较大，加样和混匀时应避免液体飞溅。

三、血清、组织和细胞样本分别怎么处理？

三类样本的前处理方法不同，下面分别说明。

1. 动物组织样本

以约 0.1 g 动物组织为例。

操作步骤：

称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 1×PBS（pH 7.4）。
使用预冷的研磨仪，在冰浴条件下进行匀浆。
匀浆后，以 10000 g、4℃ 离心 10 min。
小心吸取上清液，置于冰上待测。

推荐匀浆参数：

参数	设置
钢珠	3 颗，直径 3 mm
频率	55 Hz
每次匀浆	30 s
间隔时间	10 s
重复次数	4 次

需要注意，肝脏组织的 AST 含量通常较高，提取液一般建议稀释 20～60 倍后检测。其他组织是否需要稀释，可以通过预实验判断。

2. 细胞样本

以 5×10⁶ 个细胞为例。

操作步骤：

收集 5×10⁶ 个细胞。
使用预冷的 1×PBS 洗涤。
以 800 g 离心 2 min，弃去上清液。
加入 1 mL 1×PBS（pH 7.4）。
在冰浴条件下超声破碎。
以 10000 g、4℃ 离心 10 min。
取上清液，置于冰上待测。

推荐超声参数：

参数	设置
超声功率	20% 或 200 W
单次超声	3 s
间隔时间	7 s
重复次数	30 次
总时长	5 min

超声过程中保持冰浴，按照设定的工作与间隔时间完成破碎。

3. 血清（浆）样本

血清和血浆样本可以直接用于检测，不需要像组织或细胞一样进行匀浆和破碎。

如果预实验发现 AST 活性超过适宜检测范围，再根据需要稀释样本。

4. 样本如何保存？

优先使用新鲜样本。

如果当天不能完成处理，可以将完整细胞或分装好的组织块保存于 -80℃，并在一个月内使用。

这里需要区分保存对象：上述保存建议针对完整细胞和组织块，而不是已经制备完成的提取液。

5. 样本稀释注意事项

需要稀释时，使用 1×PBS（pH 7.4）。

每个样本的稀释倍数都应记录清楚，后续计算结果时需要用到。

如果稀释倍数较大，建议采用适当体积进行分步稀释，尽量避免直接移取过小体积的原液，以减少移液误差。

另外，这份样本提取液也可以用于 ALT 活性检测的 KTB1410、KTB2302，以及 AST 速率法检测的 KTB2303。

如果同一批样本需要同时检测 ALT 和 AST，可以在一次样本制备后按各项目需要分配提取液。

四、一块 96 孔板能测多少样本？试剂要准备多少？

实验前最好先算清楚孔数和试剂用量。

KTB1420 采用标准曲线进行结果计算，每次实验都需要在同一块板上设置标准孔。

1. 先计算总孔数

每次实验需要：

标准曲线：1 个空白孔和 4 个标准孔，共 5 孔。
每个样本：1 个测定孔和 1 个对照孔，共 2 孔。

如果本次实验有 n 个样本，且每个样本只做一组测定孔和对照孔，那么：

总孔数 = 5 + 2n

例如，检测 12 个样本：

总孔数 = 5 + 2×12 = 29 孔。

如果使用一块完整的 96 孔板，按这种单孔测定安排，最多可以检测约 45 个样本。

如果每个样本做两组复孔，每个样本就需要占用 4 孔，一块板大约可以安排 22 个样本。

2. 再计算试剂用量

按照上述孔数安排，各组分的理论用量如下：

试剂	用量计算
Reagent Ⅰ	80 + 40n（µL）
Reagent Ⅱ	100 + 40n（µL）
Reagent Ⅲ	1000 + 400n（µL）
Reagent Ⅳ	25 µL
Standard	20 µL

这里的 n 代表样本数量。注意，后面结果计算公式中的 n 代表稀释倍数，两者含义不同。

以 12 个样本为例：

项目	理论用量
总孔数	29 孔
Reagent Ⅰ	560 µL
Reagent Ⅱ	580 µL
Reagent Ⅲ	5.8 mL
Reagent Ⅳ	25 µL
Standard	20 µL

这些都是理论最低用量。

实际加样时还要考虑移液损耗。特别是使用加样槽和多通道移液器时，加样槽底部通常会残留一部分无法吸取的液体，因此应额外准备一定余量。

即使使用单道移液器逐孔加样，也建议按照实际操作习惯留出余量。

3. 血清样本至少要留多少？

每个样本占用两个孔：

测定孔：5 µL
对照孔：5 µL

因此，一次单孔测定至少需要 10 µL 血清。

如果预计需要稀释后重测，建议再预留一次检测的样本量。

若同一份血清还需要检测 ALT 或其他指标，应提前汇总各项目的样本需求，再进行分装。

4. 孔位怎么安排？

建议将同一个样本的测定孔和对照孔放在相邻位置，便于核对读数和计算 ΔA。

标准孔和空白孔可以集中安排在板的一角，与样本检测区域分开。

正式加样前，最好先做好完整的孔位记录，避免出现测定孔与对照孔对应错误的问题。

五、正式加样：按照时间顺序操作

完成样本制备和孔位安排后，就可以开始检测。

本实验的主要反应过程包括：

37℃ 孵育 30 min
37℃ 孵育 20 min
室温（25℃）静置 10 min

反应及显色过程合计约 60 min，不包括实际加样所花的时间。

1. 加样与孵育时间表

时间点	操作	孵育条件
T0	测定孔加入样本 5 µL、Reagent Ⅰ 20 µL；对照孔加入 Reagent Ⅰ 20 µL	混匀，37℃ 孵育 30 min
T+30 min	所有孔加入 Reagent Ⅱ 20 µL；对照孔补加样本 5 µL；同时配制标准孔及空白孔	混匀，37℃ 孵育 20 min
T+50 min	所有孔加入 Reagent Ⅲ 200 µL	混匀，25℃ 静置 10 min
T+60 min	使用酶标仪在 505 nm 处读数	记录各孔吸光度

其中，T+30 min 是操作较集中的时间点。

既要给所有孔加入 Reagent Ⅱ，又要给对照孔补加样本，还需要完成标准孔和空白孔的配制。

如果样本数量较多，建议提前安排好加样顺序，尽量减少不同孔之间的时间差。

2. 标准孔如何配制？

标准曲线一共设置 5 个点，包括 1 个空白点和 4 个标准点。

具体加样如下：

组分	空白孔	标准1	标准2	标准3	标准4
Reagent Ⅳ（µL）	5	5	5	5	5
Standard（µL）	0	2	4	6	8
Reagent Ⅰ（µL）	20	18	16	14	12
Reagent Ⅱ（µL）	20	20	20	20	20
对应卡门氏单位	0	24	61	114	190

Standard 加入量依次为 0、2、4、6、8 µL，Reagent Ⅰ 的加入量相应减少，保证两者合计为 20 µL。

完成配制并混匀后，标准孔与样本孔一起进行第二段 37℃、20 min 孵育。

随后所有孔加入 Reagent Ⅲ 200 µL，室温静置 10 min，再进行吸光度检测。

3. 加样时重点注意什么？

第一，对照孔的样本不能提前加。

测定孔在 T0 加入样本，而对照孔需要等到 T+30 min，和 Reagent Ⅱ 在同一阶段加入样本。

这是两个孔在操作顺序上的主要区别，不能弄反。

第二，液体尽量加到孔底，并充分混匀。

不要让液体长时间附着在孔壁上，以免影响反应和读数。

第三，控制不同孔之间的加样时间差。

尤其在 T+30 min 阶段，建议提前准备孔位图、试剂和移液器，按固定顺序加样。

让各孔尽量保持一致的孵育时间，比临时调整加样顺序更容易获得可比较的结果。

六、505 nm 读数后，实验数据怎么记录？

完成最后 10 min 显色后，在 505 nm 波长处读取吸光度。

需要记录四类数据：

A标准
A空白
A测定
A对照

其中：

ΔA测定 = A测定 − A对照

ΔA标准 = A标准 − A空白

样本 AST 活性的计算需要用到 ΔA测定，而标准曲线的拟合需要用到 ΔA标准。

1. 标准曲线如何处理？

以标准孔的 ΔA标准为横坐标，以对应的卡门氏单位为纵坐标，采用二次多项式进行拟合：

y = ax² + bx + c

得到拟合方程后，将样本的 ΔA测定代入，计算出对应的 y 值。

这里的 y 就是根据标准曲线换算得到的卡门氏单位数值。

需要注意，赖氏法在这里采用二次多项式拟合，不应直接改用线性拟合。

2. 以小鼠肝脏样本为例

假设取 0.1 g 小鼠肝脏，加入 1 mL PBS 制备组织提取液，再将上清液稀释 40 倍后检测。

得到以下数据：

记录项目	示例数值
A测定	0.361
A对照	0.234
ΔA测定	0.127
y（卡门氏单位）	55.86
稀释倍数	40
组织质量 W	0.1 g
稀释后样本计算值	0.269 U/g
计入稀释倍数后的结果	10.77 U/g

先计算：

ΔA测定 = 0.361 − 0.234 = 0.127

假设本次使用的典型标准曲线为：

y = 2175.3x² + 158.93x + 0.5902

代入 x = 0.127：

y = 2175.3×0.127² + 158.93×0.127 + 0.5902

计算得到：

y = 55.86

需要说明的是，这里采用的是典型标准曲线，仅用于演示计算过程。

每次实验的标准曲线可能存在差异，实际结果必须使用当次实验得到的拟合方程计算，不能直接套用这个示例方程。

七、AST 活性结果怎么计算？稀释倍数怎么处理？

得到 y 值后，还需要根据样本类型，换算成相应的活性单位。

1. 不同样本的计算公式

结果表达方式	计算公式
血清（浆）（U/L）	0.482 × y × n
组织（U/g）	0.482 × y × V × n ÷ W
细胞（U/10⁶ 个）	0.482 × y × V × n ÷ N
蛋白（U/g prot）	0.482 × y ÷ Cpr

各参数含义如下：

y：通过标准曲线换算得到的卡门氏单位。
n：样本稀释倍数；未稀释时，n = 1。
V：样本制备时加入的 PBS 体积，单位为 L。
W：组织质量，单位为 g。
N：细胞数量，以 10⁶ 个为单位。
Cpr：用于计算的样本蛋白浓度，单位为 g/L。

例如，组织和细胞样本制备时加入 1 mL PBS，则：

V = 0.001 L

如果使用 5×10⁶ 个细胞，则：

N = 5

2. 组织样本的计算示例

继续使用前面的小鼠肝脏数据：

y = 55.86
V = 0.001 L
W = 0.1 g
n = 40

组织活性计算公式为：

AST（U/g）= 0.482 × y × V × n ÷ W

先不计入稀释倍数，即 n = 1：

AST = 0.482 × 55.86 × 0.001 ÷ 0.1

得到：

0.269 U/g

这个数值尚未计入 40 倍稀释。

因此，需要进一步计算：

AST = 0.269 × 40

最终得到：

10.77 U/g

如果 V = 0.001 L，且样本没有稀释，组织公式也可以写成：

AST（U/g）= 4.82×10⁻⁴ × y ÷ W

实际记录时，建议同时保留稀释前后的计算信息，并明确最终报告的是已经校正稀释倍数的结果。

同一个实验课题内，应采用一致的计算与报告方式。

3. 按蛋白含量计算时，需要注意什么？

按照蛋白浓度归一化时，公式为：

AST（U/g prot）= 0.482 × y ÷ Cpr

这里要特别注意：y 和 Cpr 必须对应同一稀释状态下的样本。

如果 AST 活性检测使用的是稀释后的样本，那么代入公式的蛋白浓度也应是该稀释状态下的蛋白浓度。

此时不再额外乘以稀释倍数 n。

否则，容易造成稀释倍数被重复计算。

如果使用官网技术中心提供的在线计算器，也要先确认其对稀释倍数的处理方式。

对于计算方法有疑问，可以联系 Abbkine 技术支持：400-6800-830。

八、实验结果异常，先检查哪些地方？

1. y 值过高或过低

如果计算出的 y 值大于 150，建议使用 1×PBS（pH 7.4）进一步稀释样本后重新检测。

如果 y 值小于 3，可以考虑适当增加样本量后重新检测。

调整样本加入量时，还需要确认相应的反应体系与计算方法。

2. ΔA 为负值或接近 0

如果 A测定 − A对照得到负值，或者结果非常接近 0，可以先检查加样记录。

重点确认：

测定孔和对照孔是否对应正确。
对照孔的样本是否在 T+30 min 加入。
样本 AST 活性是否可能较低，需要调整样本用量。

这些属于常见的实验排查方向，并不意味着负值一定由某一个原因引起。

3. 复孔之间差异较大

优先检查移液和混匀过程。

本实验涉及 5 µL 样本，以及 2～8 µL 标准品等小体积加样，对移液准确性要求较高。

如果复孔差异明显，建议检查移液器量程是否合适、移液操作是否稳定，以及试剂是否加入孔底并充分混匀。

4. 标准曲线拟合效果不好

可以重点回查标准孔的配制过程：

Standard 是否按照 0、2、4、6、8 µL 准确加入。
Reagent Ⅰ 的加入量是否对应调整。
各标准孔是否充分混匀。
标准孔加样和孵育是否按照规定操作。

如果确认存在加样错误，必要时需要重新制作标准曲线。

同时注意，本方法采用二次多项式拟合，不能直接使用直线拟合代替。