丙酮酸脱氢酶（PDH）与肿瘤放疗抵抗：ACAT1巴豆酰化如何通过PDHA1磷酸化影响乳酸代谢

发表在《Communications Biology》上的一项研究，把近年受到关注的一类翻译后修饰——巴豆酰化——和肿瘤放疗抵抗的代谢机制联系了起来。

这项研究最后同样落到了PDH这个代谢节点上，但和④心肌肥厚那篇的调控路径完全不同。这里主要看看这条机制是怎么建立起来的，以及PDH活性检测在其中起了什么作用。

放疗后，为什么部分肿瘤细胞会变得更耐受

此前已经有不少研究发现，电离辐射引起的糖代谢变化与放疗抵抗有关。放疗后存活下来的肿瘤细胞，往往表现出更强的糖酵解倾向，同时伴随乳酸产量升高。

问题在于，这种代谢转向究竟是怎么被启动的，还没有完全解释清楚。

这项研究关注的就是电离辐射之后发生的分子变化：哪些修饰发生了改变，又是怎么一步步把丙酮酸代谢推向乳酸生成的。

电离辐射后，ACAT1 K181位点巴豆酰化升高

作者首先做了巴豆酰化蛋白质组学分析，比较电离辐射前后细胞内巴豆酰化修饰谱的变化。结合KEGG通路富集分析，他们筛出了一批与糖代谢有关的差异巴豆酰化蛋白，其中ACAT1（乙酰辅酶A乙酰转移酶1）的K181位点比较突出。

在MCF7（乳腺癌）、HeLa（宫颈癌）等细胞系中，8 Gy电离辐射处理后4小时，ACAT1巴豆酰化水平明显升高，而且从0到8 Gy呈剂量依赖性增加。

接下来，作者筛查了几种常见的巴豆酰转移酶，发现GCN5（KAT2A）负责ACAT1这一位点的巴豆酰化。过表达GCN5能够剂量依赖性地提高ACAT1巴豆酰化水平；敲低GCN5后，电离辐射诱导的ACAT1巴豆酰化明显减弱。

免疫共沉淀和邻近连接实验（PLA）也显示，电离辐射后GCN5与ACAT1之间的相互作用增强。

ACAT1的变化，最后会影响PDHA1

ACAT1的经典功能是催化乙酰辅酶A的硫解反应，参与脂肪酸氧化和酮体代谢。此前的研究还发现，ACAT1可以作为PDHA1（丙酮酸脱氢酶E1α亚基）的乙酰化转移酶。

PDHA1乙酰化后，更容易招募PDH激酶，随后PDHA1发生磷酸化，PDH活性受到抑制。这里“乙酰化促进激酶招募”的机制来自此前的研究，并不是这篇论文首次提出。

这篇研究继续追问：ACAT1本身发生巴豆酰化后，会不会影响它的催化能力？

实验结果显示，K181巴豆酰化会增强ACAT1酶活性。这里检测的是ACAT1自身的硫解酶活性，通过监测303 nm处的吸光度变化进行判断，与后面的PDH活性检测不是同一套体系。

ACAT1活性增强后，对PDHA1的乙酰化也随之增加。与此同时，PDHA1 S293位点的磷酸化水平升高，最终使PDH催化活性下降。

也就是说，这里可以看到这样一条关系：

GCN5介导ACAT1 K181巴豆酰化 → ACAT1活性增强 → PDHA1乙酰化增加 → PDHA1 S293磷酸化升高 → PDH活性下降。

这部分功能验证使用了PDHA1活性检测，即CheKine™ 丙酮酸脱氢酶活性检测试剂盒（KTB1270）。

作者分别检测ACAT1自身活性和下游PDHA1活性：前者确认巴豆酰化确实改变了ACAT1的催化能力，后者再判断这种变化是否进一步影响PDH功能。两项检测针对的是不同层级的问题，不能混为同一种酶活实验。

PDH活性下降后，更多丙酮酸流向乳酸

PDH活性受到抑制后，丙酮酸进入三羧酸循环的通路受限，更多丙酮酸转而被乳酸脱氢酶还原为乳酸。

作者在细胞实验中观察到，电离辐射处理后胞内乳酸水平明显升高，其变化与ACAT1 K181巴豆酰化及PDHA1磷酸化的时间过程相吻合。

如果课题中需要复现类似的代谢转向，除了测PDH活性，还可以同时关注底物丙酮酸和乳酸水平。例如，可以分别使用丙酮酸检测试剂盒（KTB1121）和乳酸检测试剂盒（KTB1100），从底物、PDH活性和乳酸生成三个层面观察代谢变化。

这里需要区分论文结果和实验设计建议：上述两个货号是针对同类实验的检测建议，不代表原论文使用的就是这两个产品。论文中丙酮酸和乳酸检测具体使用的品牌目前没有确认。

把K181位点改掉后，放疗敏感性发生了变化

为了判断K181巴豆酰化是否直接参与这条调控通路，作者构建了ACAT1 K181R突变体，把该位点的赖氨酸替换成精氨酸，以模拟不能发生巴豆酰化的状态。

结果显示，携带K181R突变的细胞对电离辐射更加敏感，同时，电离辐射诱导的乳酸升高也明显减弱。

作者还进行了裸鼠异种移植瘤实验。K181R突变体来源的肿瘤生长速度更慢，对放疗也表现出更高的敏感性。

细胞实验和体内实验的结果方向一致，支持ACAT1 K181巴豆酰化参与调节肿瘤细胞的放疗耐受。

PDH在这条通路里处于什么位置

把整套实验连起来看，这项研究建立的是这样一条调控路径：

电离辐射 → GCN5介导ACAT1 K181巴豆酰化 → ACAT1活性增强 → PDHA1乙酰化增加 → PDHA1 S293磷酸化升高 → PDH活性下降 → 乳酸生成增加 → 放疗耐受增强。

和④心肌肥厚那篇相比，两项研究的上游调控方式并不一样：一项涉及脂肪因子驱动的蛋白稳定性调控，这一项则从电离辐射诱导的巴豆酰化出发。但两条路径最后都需要通过PDH活性的变化来确认代谢功能是否真的受到影响。

因此，如果研究的问题是“某种上游修饰或信号是否最终改变了丙酮酸氧化代谢”，PDH活性检测可以作为其中一个直接的功能读数。再结合丙酮酸、乳酸等代谢物检测，可以进一步判断PDH变化之后的代谢流向。

对于巴豆酰化、琥珀酰化等酰基化修饰与代谢酶功能交叉的课题，这篇论文的实验顺序也比较清楚：先确认修饰变化，再检测酶活性，随后观察代谢表型，最后通过细胞和动物实验验证其功能后果。

原理、选购和实操层面的基础内容，可以回头看《PDH丙酮酸脱氢酶活性检测试剂盒怎么选？几个容易踩的坑》《PDH丙酮酸脱氢酶活性检测原理：DCPIP 比色法怎么测出酶活性》和《PDH丙酮酸脱氢酶活性检测实验方案：从样本制备到数据计算的完整流程》。