PDH丙酮酸脱氢酶活性检测实验方案：从样本制备到数据计算的完整流程
前两篇分别讲了怎么选PDH丙酮酸脱氢酶活性检测试剂盒，以及 DCPIP 比色法的检测原理。这一篇直接进入实验操作：从样本制备、工作液配制，到读数和数据计算，把整个流程完整走一遍。
中间也会补充一些说明书里写得比较简略、实际操作时容易遇到的问题。
实验前准备
仪器预热： 酶标仪提前预热 30 分钟以上，检测波长设置为 605 nm。仪器刚开机时，光源和检测系统还没有完全稳定，前几次读数可能出现漂移，因此不建议开机后马上开始正式检测。
试剂回温： Extraction Buffer Ⅰ、Extraction Buffer Ⅱ 和 Reagent Ⅰ 使用前都需要恢复到室温。低温试剂直接加入反应体系，会影响反应初期的温度和速率，进而影响活性计算。
预实验： 正式检测前，建议先选 2–3 个预期活性差异较大的样本做预实验。
这一步主要是确认样本量是否合适。不同物种、不同组织之间的 PDH 活性差异可能很大，如果直接按固定样本量开始正式实验，可能出现 ΔA 超出 0.01–0.3 范围的情况，最后仍然需要调整样本量重新检测。
样本制备
动植物组织和细胞/细菌的处理方法不同。组织主要采用匀浆处理，细胞和细菌则采用超声破碎。
动植物组织
称取约 0.1 g 样本，加入：
1 mL Extraction Buffer Ⅰ
10 μL Extraction Buffer Ⅱ
冰浴条件下充分匀浆，然后以 11000 g、4℃ 离心 10 min，取上清并置于冰上待测。
样本制备过程尽量保持低温，减少处理过程中酶活性的变化。PDH 活性容易受到温度和样本保存状态影响，因此不建议匀浆后长时间放在室温条件下。
细胞或细菌
收集 5×10⁶ 个细胞或细菌，用预冷 PBS 清洗，以 800 g 离心 2 min，弃去上清。
加入：
1 mL Extraction Buffer Ⅰ
10 μL Extraction Buffer Ⅱ
随后冰浴超声破碎 5 min。说明书给出的条件为：
功率：20% 或 200 W
超声 3 s
间隔 7 s
重复 30 次
超声结束后，以 11000 g、4℃ 离心 10 min，取上清置于冰上待测。
超声过程中会产生热量，因此需要维持冰浴条件。如果样本在处理过程中明显升温，应先降温再继续超声，避免温度变化影响后续检测。
样本保存
两类样本都建议尽量使用新鲜材料。
如果不能立即检测，可将原始样本置于 -80℃ 保存，最长 1 个月。完成提取后的上清则需要当天检测，不建议留到第二天再测。
如果课题特别关注 PDH 的磷酸化状态，前两篇已经提到过，建议提前联系技术支持（400-6800-830），确认提取体系对磷酸酶活性的控制情况。
另外，PDH 提取液中含有使蛋白变性的成分，因此不能直接使用这份提取液做 BCA 蛋白定量。如果需要按蛋白浓度归一化，需要另外取一份样本，用去离子水重新提取蛋白。
工作液配制
工作液需要临用前配制。
将 Reagent Ⅱ 和 Reagent Ⅲ 全部转移到 Reagent Ⅰ 中，充分混匀并使其完全溶解。
没有用完的工作液可以在 -20℃ 避光条件下分装保存 1 个月，并尽量避免反复冻融。
正式检测前，需要根据样本类型对工作液进行预温：
哺乳动物样本：37℃
其他物种：25℃
预温时间为 10 min。
这一步会影响反应开始时的温度条件。由于第一个读数点在反应开始后 20 s，如果工作液温度与设定反应温度相差较大，可能影响初始阶段的反应速率。
检测体系和读数
在 96 孔板中依次加入：
10 μL 样本
190 μL 工作液
充分混匀后立即开始计时。
在 605 nm 处检测吸光度，分别记录：
第 20 s：A₁
第 5 min 20 s：A₂
DCPIP 被还原后颜色逐渐变浅，因此吸光度会随着反应进行而下降。
吸光度变化计算为：
ΔA = A₁ - A₂
正常情况下，A₁ 应高于 A₂，因此 ΔA 为正值。如果出现负值，先检查两个时间点的数据是否记录或代入错误，同时再排查反应体系和读数过程是否存在异常。
样本多时怎么安排加样
说明书明确写了“不推荐同时检测多个样本”。
原因是这项检测看的是固定时间窗口内的吸光度变化，而不是某个统一时间点的终点吸光度。
从加入工作液开始，到完成 A₂ 读数，单个样本的检测跨度为 5 min 20 s。如果手动连续给大量孔加样，不同孔之间的起始反应时间会逐渐拉开。后面的孔还没完成加样时，前面的孔可能已经反应了较长时间，最终就很难保证每个样本都按照同一个时间窗口检测。
如果只有少量样本，可以按顺序逐个操作。
样本较多时，如果酶标仪支持针对不同孔设置独立的起始时间和读取排程，可以根据仪器功能安排错峰加样和读数。但不同型号的酶标仪功能差异较大，需要根据实际设备确认。
如果不能实现独立排程，可以考虑将样本拆成较小批次，例如每批 2–3 个，分别完成反应和读数，避免一次性铺满整板。
数据计算
先计算：
ΔA = A₁ - A₂
然后根据采用的归一化方式选择对应公式。
| 归一化方式 | 计算公式 | 适用场景 |
|---|---|---|
| 按样本质量 | PDH 活性（U/g）= 384.76 × ΔA ÷ W | 组织样本 |
| 按细胞/细菌数量 | PDH 活性（U/10⁴）= 384.76 × ΔA ÷ N | 细胞、细菌样本 |
| 按样本蛋白浓度 | PDH 活性（U/mg prot）= 384.76 × ΔA ÷ Cpr | 按蛋白量比较特异活性 |
其中：
W：样品质量，单位为 g；
N：细胞或细菌总数，以 10⁴ 为单位。例如总数为 5×10⁶ 时，N = 500；
Cpr：样本蛋白浓度，单位为 mg/mL。
如果采用蛋白浓度归一化，Cpr 需要使用前面提到的另一份蛋白提取样本测定，可配合 BCA 法蛋白定量试剂盒 KTD3001。
公式里的 384.76 是根据检测体系中的固定参数换算得到的系数，包括反应体系总体积、DCPIP 摩尔消光系数、96 孔板光径、加样体积和反应时间等。按照说明书公式计算时，不需要每次重新推导。
官网也提供在线计算器工具，可在“官网 > 技术中心 > 在线计算器”中输入原始数据进行计算。
常见问题排查
ΔA 不在 0.01–0.3
如果 ΔA < 0.01，说明检测到的吸光度变化较小。可以根据说明书建议调整样本量；原方案中也提到可以适当延长反应时间 10–15 min，但如果改变标准检测时间，需要确认后续活性计算是否仍然适用原公式。
如果 ΔA > 0.3，可以使用 Extraction Buffer Ⅰ 进一步稀释样本，或者减少样本用量后重新检测。
正式实验前做预实验，主要就是为了提前确定合适的样本浓度和加样量。
读数不稳定、重复性差
可以先检查几个常见因素：
孔内是否存在明显气泡；
移液枪是否准确；
样本和工作液是否充分混匀；
每个孔从加工作液到开始读数的时间是否一致；
样本和工作液的温度条件是否一致。
其中气泡尤其容易影响吸光度读数，加样和混匀后可以先目视检查。
显色偏浅或吸光度变化很小
可以依次检查：
工作液是否按照要求配制；
工作液保存时间是否超过要求；
是否经历多次冻融；
样本制备过程中是否一直保持低温；
样本是否在室温条件下放置过久；
样本本身的 PDH 活性是否较低。
这些因素都可能导致最终测得的 ΔA 偏小，因此不能只根据一个异常读数直接判断样本本身 PDH 活性低。
前两篇
如果还需要回看选型和检测原理，可以看前两篇：
《PDH丙酮酸脱氢酶活性检测原理：DCPIP 比色法怎么测出酶活性》
