PDH丙酮酸脱氢酶活性检测试剂盒怎么选？几个容易踩的坑
做代谢重编程相关课题，不管研究的是肿瘤 Warburg 效应、巨噬细胞极化、病毒感染后的宿主代谢变化，还是心肌肥大时的能量重塑，PDK-PDH 这个轴经常会用到。
但到了选PDH丙酮酸脱氢酶检测试剂盒这一步，几个问题很容易混在一起。比如搜“PDH试剂盒”、“丙酮酸脱氢酶检测试剂盒”，结果里可能有不少 ELISA 产品；或者按常规 96 孔终点法安排实验，实际拿到手才发现试剂盒要求分两个固定时间点读数，根本不适合一次铺满整板。
下单前，先把下面几个问题确认清楚。
先确定测的是“含量”还是“活性”
如果课题关注的是实际代谢状态，只看 PDH 蛋白表达量往往不够。
PDH 受磷酸化调控。PDK 将 PDH 磷酸化后，PDH 蛋白本身仍然存在，但酶活性可能已经明显下降。因此，如果实验要看代谢通量，或者比较药物处理后 PDH 的抑制、激活情况，需要测的是酶活性。ELISA 或 Western blot 测到的蛋白含量不能直接替代活性结果。
CheKine™ PDH丙酮酸脱氢酶活性检测试剂盒（KTB1270）检测的是 PDH 活性。
它的原理是：PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原 2,6-二氯靛酚（2,6-DCPIP）。随着 2,6-DCPIP 被还原，颜色逐渐变浅，通过 605 nm 处吸光度下降的速率计算 PDH 活性。
这套方法直接检测 DCPIP 的颜色变化，不是先生成 NADH 再通过偶联反应检测。如果同一套实验还需要监测 NAD+/NADH 比值，这种设计可以减少两类检测信号之间的干扰。如果实验并不涉及 NADH 检测，两种化学路线在实际使用上的差别通常没有那么重要。
这是动力学检测，不适合按普通终点法一次铺满 96 孔
KTB1270丙酮酸脱氢酶检测试剂盒不是加完试剂、统一孵育、最后读一次吸光度的终点比色法。
说明书明确写了“不推荐同时检测多个样本”。原因和检测方式有关：PDH 活性是根据两个时间点之间的吸光度变化计算的，需要记录第 20 秒和第 5 分钟 20 秒的读数。
如果手动连续给很多孔加样，后面的孔还没加完，前面的孔可能已经反应了几分钟。这样每个孔实际经历的反应时间不同，最后算出来的 ΔA 就不再具有可比性。
所以安排实验时，不能直接照搬普通 96 孔终点法的节奏。样本多的话，需要提前考虑加样速度、读板方式和人员安排。
注意磷酸化状态，以及 BCA 定量的兼容性
PDH丙酮酸脱氢酶的活性状态和磷酸化有关，因此样本裂解后的处理条件会直接影响结果。
如果内源磷酸酶在裂解后继续作用，PDH 可能在提取过程中发生去磷酸化，最后测到的活性就可能高于样本处理结束时的真实状态。
说明书对 Extraction Buffer Ⅱ 只注明“具有一定的毒性，请操作时做好防护措施”，没有列出具体成分。如果课题很依赖 PDH 磷酸化状态，下单前最好直接向技术支持确认提取体系对磷酸酶活性的控制情况。技术支持电话为 400-6800-830。这里不建议仅根据缓冲液名称或用途自行判断是否已经加入磷酸酶抑制成分。
另一个需要提前安排的是蛋白定量。
说明书注明，提取液中含有使蛋白变性的成分，因此不能直接用这份 PDH 提取液做 BCA 蛋白定量。如果实验需要按蛋白浓度归一化，需要另外取一份样本，用去离子水重新提取蛋白。
说明书推荐配合同厂商的蛋白质定量试剂盒（BCA 法，货号 KTD3001）。
48 T 和 96 T 怎么选
这款试剂盒适用于动植物组织、细胞和细菌，采用微量法，每孔使用 10 μL 样本。
规格分为 48 T 和 96 T：
| 规格 | 大致可测样本数（含预实验/标曲预留） |
|---|---|
| 48 T | 约 43–48 个正式检测孔 |
| 96 T | 约 86–96 个正式检测孔 |
每种规格额外提供 10% 的试剂量用于预实验。
这部分最好不要省。说明书要求最终读数的 ΔA 落在 0.01–0.3 区间。ΔA 太小，说明信号不足；ΔA 太大，则需要用 Extraction Buffer Ⅰ 稀释样本。
不同物种、不同组织之间的 PDH 活性差异可能很大，没有一个通用的样本用量可以直接套用，所以正式实验前通常需要先做预实验。
是否需要线粒体分离，要看实验问题
说明书提供的样本制备流程是直接对组织或细胞进行匀浆、裂解，离心后取上清检测，没有包含线粒体分离步骤。
因此，按说明书直接操作时，测到的是全细胞或全组织裂解物中的 PDH 活性。
PDH 主要位于线粒体基质。对于常规的 PDH 活性比较，这种处理方式通常可以直接使用。但如果实验设计要求严格区分线粒体和胞浆两个区室的信号，就需要在样本制备阶段自行加入线粒体分离步骤，这不是试剂盒本身提供的流程。
做代谢重编程，通常还需要看 PDH 前后的节点
几篇使用过这款试剂盒的文献，包括 Redox Biology、Nature Communications 和 Communications Biology 中的相关研究，并没有只测 PDH丙酮酸脱氢酶活性。
实际实验中，PDH丙酮酸脱氢酶经常会和丙酮酸浓度、丙酮酸激酶活性、ATP、乳酸等指标一起检测。
原因也比较直接：PDH 位于糖酵解产物进入三羧酸循环的位置，只看 PDH 一个节点，很难判断上游底物、下游氧化以及乳酸分流分别发生了什么变化。
文献中出现过的相关指标包括：
| 通路位置 | 检测指标 | 货号 |
|---|---|---|
| 糖酵解末端限速（生成丙酮酸） | 丙酮酸激酶（PK）活性 | KTB1120 |
| PDH 的直接底物 | 丙酮酸浓度 | KTB1121 |
| 糖酵解通向三羧酸循环的关卡 | PDH 活性 | KTB1270 |
| 有氧氧化的产出 | ATP 含量 | KTB1016 |
| PDH 受抑时的代偿去向 | 乳酸含量 | KTB1100 |
这些并不是官方打包套装，只是文献实验设计中实际出现过的组合。具体测哪些指标，还是要根据课题假设来定。
下单前再确认这几项
- 样本需要尽量新鲜。不能立即检测时可在 -80℃ 保存，最长 1 个月；已经完成提取的样本上清需要当天检测，不能留到第二天。
- 试剂盒保质期为 -20℃ 避光保存 6 个月。到货后按说明书要求保存，其中 Extraction Buffer Ⅱ 和 Reagent Ⅲ 都要求 -20℃ 避光。
- 仪器需要能够读取 605 nm，并满足两个时间点的动力学读数要求。
- 普通分光光度计也可以使用，但各试剂的配制量需要按比例调整。
- 本产品仅供科研使用，不用于临床诊断。
把检测对象、读数方式、样本处理和归一化方法提前确定下来，基本就能避开选型阶段最常见的几个问题。
后续再展开具体检测原理和实验操作流程。
