活性氧ROS含量检测全指南：原理、步骤、方法及细胞实验方案

一、为什么几乎所有“氧化应激”课题都离不开 ROS？

这两年只要做氧化应激、铁死亡、心血管、糖尿病并发症、神经退行性疾病，基本都会写一句：

检测 SOD、MDA、GSH、ROS 等氧化应激相关指标。

SOD、MDA 这些大家都很熟，真正动手做细胞实验时，ROS 反而是最容易让人有点没底的那个：

• 它到底代表了什么过程？
• 不同探针、不同方法之间差别多大？
• 说明书推荐的浓度、时间，能不能直接照抄到自己的细胞系上？

先把问题说清楚：活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS） 是细胞氧代谢的“副产物”，但不是纯粹的“垃圾”——在正常情况下，它参与信号转导、免疫防御、细胞分化等一堆精细调控；一旦失衡，ROS 过量，就进入我们熟悉的“氧化应激”状态，开始：

• 攻击膜脂，形成 MDA 等脂质过氧化产物；
• 氧化蛋白质、DNA，改变功能甚至引发细胞死亡；
• 参与动脉粥样硬化、糖尿病并发症、骨质疏松、中风、炎症、自身免疫、神经退行性疾病和肿瘤的发生发展。

所以很多课题会把 ROS 当成一个比较前端的 readout：

“模型成没成？刺激起没起效？下游那一堆 SOD/MDA/GSH 的变化是否有依据？”

先看一眼细胞内 ROS，往往心里就有数了。

二、常见 ROS 检测思路：为什么大家最后都绕回了荧光探针？

从方法学上看，常见的 ROS 检测大致可以分几类：

1. 电子自旋共振（ESR）：

   理论上最“硬核”，能直接捕获自由基信号，但设备昂贵、操作复杂，对日常细胞实验来说不太现实。

2. 比色 / 化学发光：

   方案简单、成本低，但灵敏度和特异性有限，更适合做一些整体的氧化状态评估，而不是精细到单细胞水平。

3. 荧光探针法（重点）：

   用不同的荧光探针（如 DCFH-DA、DHE、MitoSOX 等），在单细胞水平监测 ROS 的变化。

• 好处是：灵敏、直观、适配流式细胞仪 + 荧光显微镜，
• 文献数量多，方便和别人对比结果。

如果只看“日常实验室”的配置和习惯，大部分人最后都会回到一条路上：

DCFH-DA + 流式/荧光显微

做一次标准的“细胞内 ROS 检测”。

下面就只盯着这条主流路线，把原理、操作和坑一点点摊开。

三、DCFH-DA 荧光探针：原理说清楚，后面就不容易乱

DCFH-DA 是什么？

• 它本身是无荧光的小分子探针，能穿过细胞膜；
• 进入细胞后，被细胞内的酯酶水解，形成不易透膜的 DCFH（还原态）；
• 细胞内的 ROS 把 DCFH 氧化成有荧光的 DCF；
• 我们实际测到的是 DCF 的荧光强度。

常规参数：

• 激发波长：约 488 nm
• 发射波长：约 525 nm（FITC 通道）

所以不管你是用流式细胞仪还是荧光显微镜，基本都是走 FITC 那一路，这对仪器兼容性非常友好。

DCFH-DA 的几个现实优势：

• 方案成熟，文献案例多，审稿人看了不陌生；
• 大部分流式和荧光显微镜都可以直接用；
• 对多数贴壁细胞、悬浮细胞都适用；
• 一套试剂盒搞定探针 + 阳性对照，实验设计相对省心。

但要用好它，有两个前提：

1. 细胞状态要好（密度合适、不过度融合、不过度死亡）；
2. 探针浓度、孵育时间、阳性对照刺激条件要在一个合理区间，而不是“越多越强，越久越好”。

四、用 DCFH-DA 做一次“标准的细胞 ROS 实验”：一步步过一遍

这里以细胞内 ROS 检测为例，用**CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法）**的典型设置来讲一遍思路，你后面可以按自己的细胞系微调参数。

1. 细胞准备

• 贴壁细胞建议提前 24 h 接种好，保证处于对数生长期；
• 密度不要太满，避免细胞互相挤压，影响探针进入和 H₂O₂ 刺激效果。

2. 探针储备液与工作液

试剂盒内的 DCFH-DA 一般是10 mM 储备液（-20 ℃ 避光保存）。使用前：

• 用无血清培养基稀释成工作液，常用起始终浓度是10 μM；
• 如果后来发现背景偏高，可以把终浓度往下调到2–5 μM，对应大约 1:2000 – 1:5000 稀释。

小提示：

不同细胞对探针浓度敏感性不一样，第一次做可以设一组小梯度，比如 2 μM、5 μM、10 μM，对比一下背景和信号。

3. 探针装载（原位装载为例）

1. 弃掉含血清的培养基，轻轻 PBS 洗一次；
2. 加入含 DCFH-DA 的无血清培养基，覆盖细胞；
3. 37 ℃、避光孵育15–30 min 作为起点（有的细胞 30–60 min 效果更好）；
4. 孵育结束后，用无血清培养基或 PBS 轻轻洗2 次，把未进入细胞的游离探针彻底洗掉；
5. 换回适当的培养基或缓冲液，进入后续刺激 / 检测步骤。

这一段最关键的是：装载完一定要洗干净，否则背景会非常夸张，看不出组间差异。

4. 阳性对照 H₂O₂ 的设计

ROS 实验几乎都需要一个“阳性对照”，用来证明：

这套探针和细胞条件，确实能监测到 ROS 的上升。

常规做法：

• H₂O₂ 储备可配成高浓度，分装 -20 ℃ 或 4 ℃ 保存；
• 实验当天现配工作液，终浓度一般从50–100 μM起步，可扩展到50–200 μM 区间；
• 刺激时间：30 min – 4 h，具体视细胞耐受程度和 ROS 生成速度而定。

实际操作建议：

• 第一次做，可以排一个简单矩阵：
• 浓度：50 / 100 / 200 μM
• 时间：30 min / 1 h
• 找到既能拉开对照组差距、又不过度杀伤细胞的那一档，后面就按这个条件走。

注意：阳性对照（H₂O₂）只需要加在阳性对照孔或阳性样本里，用来证明体系是“活”的，不是每个实验组都要加。

5. 检测：显微 or 流式？

荧光显微镜：

• 选择 FITC 滤光片（Ex 488、Em 525 nm 左右）；
• 曝光时间尽量短一些，以“不饱和、不糊”为前提；
• 关键点：试验组和对照组的曝光时间必须完全一致，否则没法比强度。

流式细胞仪：

• 用 488 nm 激光 + FITC 通道；
• 细胞制成单细胞悬液，浓度控制在 0.5–1×10⁶/mL 左右；
• 至少收够 1–2 万个细胞事件；
• 分析时可以看总体荧光强度直方图，也可以在 FSC/SSC 上把死亡细胞、碎片排除掉。

五、ROS 实验最容易翻车的几个点

只要做过几次，你大概率会遇到下面这些问题：

1. 阴性对照也很亮，背景高到没法看

常见原因：

• 探针浓度太高；
• 装载时间过长；
• 装载后没洗干净游离探针；
• 显微镜曝光时间设得太猛。

解决思路：

• 把 DCFH-DA 终浓度往下调到2–5 μM；
• 先从15–20 min 装载 试起，不要一上来就 1 h；
• 装载后多洗一遍，换新培养基再观察；
• 显微镜一定先调好曝光，再一口气拍完所有组，避免中途反复调节。

2. 阳性对照不亮，像没被刺激到

常见原因：

• H₂O₂ 浓度过低；
• 刺激时间太短；
• H₂O₂ 放久了，活性不太行了；
• 细胞本身抗性比较强。

解决思路：

• 把浓度从 50 μM 往上调到 100–200 μM 试一圈；
• 刺激时间拉长到 1–2 h，看信号增长情况；
• 确保 H₂O₂ 是当天现配的工作液；
• 有条件可以换一个敏感一点的细胞系先跑通体系。

3. 信号很高，但细胞状态一塌糊涂

常见原因：

• H₂O₂ 过量，已经进入“毒死”的范围；
• 探针装载和刺激时间叠加太长；
• 细胞密度太低或本身就不健康。

解决思路：

• 下调 H₂O₂ 浓度，或缩短刺激时间；
• 探针装载时间控制在一个相对保守的范围（例如 20–30 min）；
• 严格筛细胞状态：重度凋亡 / 膜完整性破坏的细胞，测出来的“ROS”意义不大。

4. 不同批次试剂混用，结果莫名其妙

这一点很多人会忽略：

• 不同批次的探针、不同厂家的阳性对照，尽量不要混着用；
• 同一个实验里，最好用同一盒试剂、同一批号，保证前后一致。

六、ROS 在整套氧化应激指标里的位置

做氧化应激相关课题时，一般不会只测 ROS 一个指标，常见搭配是：

• ROS + MDA：

  一个看“前端活性氧”，一个看“脂质过氧化产物”；

• ROS + SOD/CAT/GSH-Px：

  从“攻击”和“防御”两个方向看氧化应激状态；

• ROS + GSH：

  配合谷胱甘肽消耗情况，分析细胞抗氧化能力。

思路上可以简单记一下：

ROS = “氧化攻击有多猛”
SOD/CAT/GSH-Px/GSH = “机体防守有多强”

MDA 等 = “被打烂之后留下的痕迹”

如果你本身就有一整条 CheKine™ 氧化应激试剂盒线在用（SOD、CAT、MDA、GSH、GSH-Px 等），那把ROS 加进去，就相当于给整套 panel 多加了一个“前端预警”的维度。

七、如果你想要一套相对省心的 ROS 检测方案

从实用角度讲，做 ROS 实验最麻烦的地方在于：

• 自己摸索探针浓度、孵育时间、阳性对照的梯度，前几次往往比较耗时间；
• 说明书写得太简略，很多细节要靠自己踩坑总结。

像这类已经把参数区间写清楚、顺手又适配两种检测方式的试剂盒，会省掉你很多来回试错的时间。比如：

CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法）：

• 以 DCFH-DA 为核心探针，10 mM 储备液，-20 ℃ 避光保存；
• 提供了阳性对照 H₂O₂（50 mM 储备），说明书里直接给出推荐终浓度（50–200 μM）和刺激时间（30 min–4 h）的参考范围；
• 操作流程同时兼容流式细胞仪和荧光显微镜，说明书里把探针装载、洗涤、孵育等关键步骤写得比较细，对初次做 ROS 的实验室比较友好；
• 注意事项里也把“不同批次 / 不同厂家之间不要混用、装载后要洗干净探针、阴性背景高时如何调浓度和时间”等小细节提前讲明白。

如果你已经有固定的细胞系和模型，只需要在这个框架上微调 1–2 轮，大多数情况下就能得到一套比较稳定、可复现的 ROS 检测方案。