如何在HeLa、RAW264.7、SH-SY5Y等常用细胞系中做ROS检测？

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是很多体外模型绕不开的指标，但真正做实验时，经常会遇到这些情况：

• 换了一个细胞系，原来的 H₂O₂ 条件完全不好使；
• 同样是 DCFH-DA 探针，有的细胞背景很高，有的细胞几乎不发光；
• 刺激时间点不好抓，测早了没变化，测晚了细胞已经大片死亡。

这篇文章不再讲原理，而是聚焦在具体细胞系场景上，围绕三类常用细胞——HeLa、RAW264.7、SH-SY5Y，整理一套可以落地的 ROS 检测思路。 默认使用的是基于DCFH-DA 荧光探针 的细胞ROS检测试剂盒（例如 CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法）这一类体系）。

一、先统一一个“基础版” ROS 操作框架

不管是 HeLa、RAW264.7 还是 SH-SY5Y，大的实验框架是相似的，可以先统一下来：

1. 建立模型
• 高糖 / H₂O₂ / LPS / MPP⁺ 等刺激，按课题设计处理到预设时间点。
2. 弃去培养基，PBS 或无血清培养基轻洗 1 次。
3. 探针装载
• 用无血清培养基将 DCFH-DA 稀释至终浓度约 10 μM 作为起始条件；
• 37 ℃、避光孵育15–30 min。
4. 洗涤
• 探针装载结束后，用无血清培养基再洗 1–2 次，去掉游离探针。
5. 读数方式
• 荧光显微：直接在培养板中补加少量无血清培养基，上荧光显微镜（FITC 通道）；
• 或者消化成单细胞悬液，用 PBS 重悬后上流式细胞仪（488 nm 激发、约 525–530 nm 发射）。

后面不同细胞系的差异，主要体现在刺激方式、刺激强度和检测时间点，下面分别展开。

二、HeLa：适合作为“标准化操作的示范细胞”

HeLa 是做ROS检测非常经典的一种细胞系，贴壁稳定、增殖快、对 H₂O₂ 等氧化刺激较敏感，适合用来先跑通一套标准流程，再迁移到其他细胞。

1. H₂O₂ 急性氧化应激模型

目的： 搭建一套简单、反应明确的氧化应激模型，用于方法摸索或药物筛选。

操作建议：

• 铺板
• 如 24 孔板，每孔接种约 5×10⁴–8×10⁴ 个 HeLa 细胞，过夜贴壁。
• 刺激条件（参考范围）
• H₂O₂ 终浓度：建议从100、200、400 μM 做梯度预实验；
• 刺激时间：先以30–60 min 为起点；
• 通过细胞形态和存活率（如 CCK-8）确定一个“应激明显但未大面积死亡”的状态。
• ROS 检测
• 在刺激结束时（如 30 min 或 60 min），弃去培养基，PBS 洗 1 次；
• 加 DCFH-DA 工作液（终浓度约 10 μM），37 ℃ 避光孵育 30 min；
• 洗 1–2 次，换无血清培养基后，进行显微或流式检测。

2. HeLa 小结

• 对 H₂O₂ 比较敏感，建议从中等浓度起步，逐步摸索；
• 贴壁牢固，洗板操作相对宽松；
• 非常适合用作“方法起步细胞”，先把探针浓度、装载时间、曝光参数跑顺，再推广到其他细胞系。

三、RAW264.7：巨噬细胞的 ROS 与炎症激活

RAW264.7 是经典小鼠巨噬细胞系，天然就有较强的 ROS 产生能力，广泛用于炎症、免疫相关课题。

在这个模型里，刺激方式的选择会直接影响 ROS 的模式和时间特征。

1. LPS 等炎症刺激模型

典型场景： 想观察炎症激活过程中，巨噬细胞 ROS 的变化。

操作参考：

• 铺板
• 24 孔板每孔约 5×10⁵ 个 RAW264.7，过夜贴壁。
• 刺激条件
• 想看急性 ROS 可选2–6 h；
• 若同时做炎症因子表达，常见的处理时间是 12–24 h。
• LPS 终浓度：一般可在100 ng/mL – 1 μg/mL 之间选择；
• 刺激时间：
• ROS 检测时间点
• 可在 LPS 处理2–4 h 时设置一个早期 ROS 检测时间点，
• 与 NO、细胞因子、蛋白表达等中后期 readout 配合使用。

2. PMA 诱导呼吸爆发模型

特点： ROS 升高迅速且强烈，适合作为功能 readout。

• PMA 终浓度：常用50–200 nM；
• 刺激时间：30–60 min；
• 适合评估某些药物或处理对呼吸爆发的影响。

3. RAW264.7 小结

• 刺激方式会明显影响 ROS 时间曲线：LPS 相对缓慢，PMA 更急性；
• 细胞贴壁相对较弱，洗板动作要轻；
• 对于 LPS 长时间处理的实验，更建议在处理末端再装载 DCFH-DA，而不是在整个处理过程中长期共孵育探针。

四、SH-SY5Y：神经样细胞中的 ROS，更看重“时间累积”

SH-SY5Y 等神经样细胞，常用于神经毒性、帕金森样模型等研究。

这类细胞对氧化应激较敏感，且 ROS 往往伴随线粒体功能改变、凋亡等过程逐步累积。

1. H₂O₂ 急性损伤模型

操作建议：

• 铺板
• 24 孔板每孔约 5×10⁴–8×10⁴ 个 SH-SY5Y，过夜贴壁。
• 刺激条件
• H₂O₂ 终浓度：可从100–300 μM 做梯度；
• 刺激时间：多在2–6 h 范围内，根据细胞状态微调。
• ROS 检测
• 在处理结束时进行 DCFH-DA 装载与检测；
• 若配合线粒体膜电位（如 JC-1）等指标，可在早中期分别取样。

2. MPP⁺ 等慢性毒性模型

针对帕金森病相关研究，常用 MPP⁺ 等诱导神经毒性：

• MPP⁺ 浓度：如0.5–2 mM；
• 处理时间：常见为24 h 及以上；
• ROS 检测时间点：
• 可在 12 h、24 h 甚至更长时间点进行检测，关注 ROS 是否随毒性累积而上升；
• 同时结合凋亡、线粒体功能等指标进行综合分析。

3. SH-SY5Y 小结

• 对氧化应激比较敏感，H₂O₂ 浓度宜逐步摸索，避免过强刺激；
• 若计划联合检测线粒体功能、凋亡等，建议在细胞大量死亡前安排 ROS 测定时间点，使数据更具可解释性。

五、将“细胞系 + ROS 条件”整理成可复用模板

实际工作中，建议把不同细胞系的经验参数整理成一张小表，作为实验室内部的“ROS 条件库”，例如：

• HeLa
• 模型：H₂O₂ 100–400 μM，30–60 min
• 探针：DCFH-DA 10 μM，37 ℃ 30 min
• 检测：荧光显微 / 流式
• RAW264.7
• 模型 1：LPS 100 ng/mL–1 μg/mL，2–6 h 看急性 ROS
• 模型 2：PMA 50–200 nM，30–60 min
• 探针及检测：同上
• SH-SY5Y
• 模型 1：H₂O₂ 100–300 μM，2–6 h
• 模型 2：MPP⁺ 0.5–2 mM，12–24 h
• 探针及检测：同上

在此基础上，再结合具体课题需求，逐步微调刺激剂量、处理时间和探针装载条件，就能形成一套既稳定又具可迁移性的“细胞 ROS 检测 SOP”，减少重复踩坑的时间成本。