ROS活性氧试剂盒(KTB1910)使用全攻略：10个细节+高频FAQ
做细胞 ROS 的同学，大多都有类似经历：
- 说明书看了两遍，第一反应是「好像也不难」；
- 上机之后发现：阴性太亮、阳性不亮、重复性一般；
- 技术支持问一句「探针装载多久？终浓度多少？」才发现自己哪一步“想当然”了。
这篇不是再给你念一遍说明书，而是把我们在 CheKine™ 活性氧（ROS）含量检测试剂盒（荧光法，KTB1910）日常技术咨询里遇到的共性问题，整理成一份「使用全攻略」：
- 上半部分：10 个最容易被忽略的细节
- 下半部分：围绕KTB1910 的高频 FAQ 做一轮集中的解答
希望你看完之后，再做 DCFH-DA ROS 实验，能少踩几次坑。
一、10 个最容易被忽略的使用细节
1. DCFH-DA 是 10 mM 储备，不是“开盒即用”的工作液
KTB1910 里的 DCFH-DA 是10 mM 储备液，用之前一定要：
- 先用无血清培养基配成工作液；
- 再按细胞类型调终浓度。
我们给出的推荐区间是：
- 常规起步浓度：10 μM；
- 阴性背景偏高时：终浓度可以降到2–5 μM（大约 1:2000–1:5000）。
很多背景高的实验，问题就在于「直接照搬别家文献的浓度」，没结合自己的细胞做过一次小梯度摸底。
2. 探针装载时间是 15–60 min 的区间，而不是“死规定”
DCFH-DA 装载时间对背景和信号影响很大：
- 一般推荐从30 min 起步；
- 如果信号偏弱，可以向 45–60 min 调整；
- 如果阴性太亮，就往 15–20 min 缩。
真正关键的是——同一块板上所有样本装载时间必须统一。
有的孔 20 min，有的孔 40 min，重复性肯定会出问题。
3. 阳性对照 H₂O₂ 只放在阳性对照里，不是所有孔都要加
KTB1910 随附的阳性对照是用于制备 H₂O₂ 阳性样本的，不是「每个处理上再补一丢丢」。
比较合理的设计是：
- 阴性对照：只走基础细胞处理 + 探针；
- 实验组：按课题设计给药/刺激 + 探针；
- 阳性对照：单独一组加 H₂O₂（比如 100 μM，30–60 min），用来确认体系能拉起足够强的 ROS 信号。
如果所有孔都加上 H₂O₂，这个试剂组就变成了「混合应激」，很难解读。
4. H₂O₂ 阳性对照浓度和时间是可以“微调”的
我们给用户的建议浓度区间是50–200 μM，时间一般在30 min–4 h 之间，具体要结合细胞系和细胞状态：
- 30 min 内信号不明显 → 可以适当拉长刺激时间，或者略微升高浓度；
- 细胞状态明显变差、脱落严重 → 就要反向减浓度或缩时间。
可以做一轮简单的「浓度–时间矩阵」小摸底：
- 例如：50 / 100 / 200 μM × 30 min / 1 h，
- 选出一组既有清晰 ROS 升高，又不至于大量凋亡的阳性对照条件，后续就可以固定使用。
5. 阴性背景高，优先从这三步排查
如果你发现阴性对照也很亮，可以先按下面顺序调整：
- 降低探针终浓度：比如从 10 μM 降到 5 μM、2.5 μM；
- 缩短装载时间：从 30–60 min 调到 15–20 min；
- 认真洗探针：装载结束后，用无血清培养基或 PBS 洗 1–2 次，去干净细胞外游离探针。
很多时候，单纯把浓度从 10 μM 调到 5 μM，再把装载时间控制在 20–30 min 内，背景就会好很多。
6. 探针装载后到检测，时间拖得越久误差越大
一个很容易被忽略的点是：
装载完成以后，并不是可以随便放着等几个小时再读数。
比较稳妥的做法是：
- 分批次操作：哪几列孔装载完、洗干净，就尽快进入显微或流式检测；
- 不要出现「第一组装完等了 15 分钟，最后一组等了 1 小时」这种情况。
装载后「额外多放半小时」，确实有可能带来更多非特异信号。
7. 洗涤步骤不要偷懒：洗不干净，整个视野都会泛绿
很多背景高的图，根本原因不是探针本身，而是：
- 装载后没有认真洗；
- 培养基里还残留不少游离 DCFH-DA。
简化版建议：
- 装载结束 → 弃去装载液；
- 加等体积无血清培养基 / PBS，轻轻晃动，静置 1–2 min；
- 再彻底倒掉上清；
- 必要时可重复 1 次。
对贴壁细胞来说，洗的时候动作不要太猛，避免大片掉板；对悬浮细胞，则需要通过离心 + 重悬来完成完整的洗涤。
8. 显微拍照记得「统一曝光」，否则图看着好看，数据很难用
在用荧光显微镜观察 ROS 时，建议按下面流程来：
- 先选一组信号相对亮的样本（如阳性对照），调一个不过曝的曝光时间；
- 固定这个曝光参数，用在同一实验下的所有样本；
- 不在不同组之间来回改曝光。
这样做的好处是：
- 你看到的亮度差异才可比；
- 后续如果需要做图像定量，也有统一的基础。
9. 不同批次、不同厂家的组分不要混在一起用
为保证数据可比性和质控可控，建议：
- 一次实验尽量使用同一批号的 KTB1910；
- 不要把别家试剂盒的阳性对照、buffer 拿来和 DCFH-DA 随意组合。
一旦出现“混搭”，实验异常时就很难判断问题到底出在哪一步，技术支持也帮不到太多。
10. 保存 / 运输：关注两件事就够了
对这个试剂盒来说，保存和运输关注两个点：
- 长期保存：收到后置于-20 ℃ 避光保存，具体以包装清单为准；
- 冻融次数：频繁使用的组分（DCFH-DA、阳性对照等）建议适当分装，减少来回冻融。
运输一般采用冰袋（蓝冰），中途只要不是长时间暴露在高温环境，正常接收后及时转入对应温度即可。第一次使用时配一组阳性对照，可以顺带验证一下试剂状态。
二、KTB1910 高频使用 FAQ 精选
下面这些问题几乎每天都在被问，集中放在一起，方便你查。
1. DCFH-DA 建议用什么稀释？可以用 PBS 吗？
建议优先用无血清培养基来稀释 DCFH-DA 配工作液。
- 有血清的体系可能影响探针进入细胞，背景也会略高；
- 简单 PBS 也可以用来短期孵育，但不一定适合所有细胞长时间共孵育。
如果想稳妥一些，延续细胞原本的培养体系，只是去掉血清，是相对平衡的选择。
2. 不同细胞系都用 10 μM / 30 min 吗？
可以用「10 μM + 30 min」作为第一次使用时的起步条件，但不建议一刀切地永久照搬到所有细胞系。
更好的做法是：
- 针对每一类新细胞，至少做一次小范围摸底：
- 终浓度：2.5、5、10 μM；
- 装载时间：20、30、45 min；
- 找到既有良好信噪比、又不会带来明显毒性的组合，之后在该细胞系内固定使用。
3. 悬浮细胞（如 THP-1）可以用 KTB1910 吗？操作上有什么要注意？
可以。
流程大致是：
- 在离心管中完成药物/刺激处理；
- 处理结束后离心，弃上清，加入含 DCFH-DA 的工作液孵育；
- 孵育结束后，以 PBS 或无血清培养基洗 1–2 次；
- 重悬后上流式检测，或滴片做显微观察。
要注意的是，离心力不要开太大，避免细胞损伤，整个过程尽量避光。
4. 流式检测时，应该怎么设门、怎么看数据？
建议流程：
- FSC/SSC 排除碎片和明显死亡细胞；
- 在活细胞群体中看 FITC 通道的荧光强度；
- 数据可用：
- MFI（平均荧光强度）比较各组；
- 或设定阈值，看阳性细胞百分比。
若有阳性对照组，可以直接用阳性对照的峰值和阴性对照的基线来判断激活程度。
5. 只做显微，不做流式可以吗？
可以的。很多用户会把 KTB1910 直接作为「荧光显微看 ROS」的工具：
- 探针装载、洗涤后直接在培养板上观察；
- 配合 DAPI 等染核，可以同时观察细胞形态。
如果你的课题更偏定性或半定量，显微已经足够。如果想要更精确的定量，建议配合流式。
6. 可以和 MDA、SOD 等其他氧化应激指标配合使用吗？
完全可以，甚至推荐这样搭：
- 在细胞层面：用 KTB1910 看细胞内 ROS；
- 在组织/血清层面：用 MDA、SOD、GSH-Px、GSH 等试剂盒评估脂质过氧化和抗氧化防御。
这样更容易在文章里讲清楚：
处理 → ROS 升高 → 抗氧化酶活性变化 → MDA 上升 → 组织损伤
7. KTB1910 适用于组织匀浆或血清吗？
KTB1910 的设计初衷是针对细胞内 ROS（流式/显微），默认对象是各种培养细胞系。
如果要测组织匀浆 / 血清 / 血浆中的氧化应激水平，更适合选择针对这些样本优化的试剂盒，例如 MDA 脂质过氧化、T-AOC、SOD 活性等，而不是直接用 DCFH-DA 做体系外 ROS 检测。
8. 一块板上做多个处理，ROS 的时间点怎么抓？
对于大多数「急性应激」模型（比如 H₂O₂、PMA 等），建议：
- 在刺激后 30 min–2 h 内选一两个时间点做 ROS；
- 同一块板上所有孔最好在一个相对集中的时间窗内完成装载和检测。
对于「慢性模型」（如高糖、药物长时间处理），可以：
- 在 24 h、48 h 甚至更久时间点上做 ROS；
- 同时在对应时间点测细胞活性、凋亡或其他功能指标，方便综合分析。
